Se le llama cultivo celular al proceso mediante el cual las células, ya sean eucariotas o procariotas, pueden cultivarse en condiciones controladas. Dicho de otra manera, es un conjunto de técnicas que nos permiten mantener células in vitro con una gran aproximación a sus propiedades y funciones in vivo.
En la práctica el término "cultivo celular" se usa normalmente en referencia al cultivo de células aisladas de eucariotas pluricelulares, especialmente células animales.
El desarrollo histórico y metodológico del cultivo celular está íntimamente ligado a los péptidos cultivares del cultivo de tejidos y el cultivo de órganos.
El cultivo de células animales empezó a ser una técnica rutinaria de laboratorio durante los años 50, pero el concepto de mantener líneas de células vivas separadas del tejido de origen fue descubierto en el siglo XIX.
El fisiólogo inglés Sydney Ringer desarrolló a finales del siglo XIX una solución salina, conocida como solución de Ringer, que contiene cloruro de sodio, potasio, calcio y magnesio, dicha solución es capaz de mantener latiendo el corazón de un animal fuera del cuerpo.
En 1885 Wilhelm Roux extrajo una porción de la médula de embrión de pollo y la mantuvo varios
días en cultivo en una solución salina tibia, estableciendo el principio de los cultivos tisulares. Ross Granville Harrison, trabajando en la Escuela de Medicina de la Universidad Johns Hopkins y más tarde en la Universidad de Yale, estableció la metodología del cultivo tisular en una serie de trabajos publicados entre 1908 y 1910.
Las técnicas de cultivo celular avanzaron significativamente en los 40 y 50, como soporte a la investigación en virología. La utilización de cultivos celulares para producir virus permitió preparar virus purificados para ser utilizados en vacunas. La vacuna Salk de la polio fue una de los primeros productos producidos en masa usando técnicas de cultivos celulares. Esta vacuna fue posible gracias a la investigación de John Franklin Enders, Thomas Huckle Weller y Frederick Chapman Robbins, quienes fueron galardonados con el Premio Nobel por el descubrimiento de un método de crecimiento de virus en cultivos celulares de riñón de mono.
Clasificación
Existen diferentes tipos de cultivos, y el término "cultivo de tejidos" es el nombre genérico para incluir tanto el cultivo de órganos como el cultivo de células.
- Cultivo de órganos. Este grupo de técnicas comprende el cultivo de órganos completos con la intensión de preservar la estructura histológica tridimensional original de donde fueron disecados. Generalmente se cultivan órganos embrionarios, cuyo objetivo principal es el estudio de los mecanismos que controlan su desarrollo, sin embargo en años recientes se ha iniciado el cultivo de órganos "adultos" reconstruidos principalmente para substituir la necesidad de obtenerlos a partir de donadores en el transplante de órganos. Un tipo especial de cultivos reconstituidos es el histotípico, en donde se disgrega el tejido original por tratamientos generalmente enzimáticos y se reasocian las células para recrear in vitro la estructura tridimensional del órgano que le dio origen. Existe un tipo especial de cultivo histotípico denominado organotípico en donde se reasocian células de diferentes linajes. Este tipo de cultivos sirve para analizar las interacciones intercelulares necesarias para que se reorganicen estructuralmente los órganos, o para analizar el comportamiento de las células que los componen (diferenciación, migración, proliferación, muerte y envejecimiento).
- Cultivo de células. Este tipo de cultivos se inician a partir de cultivos primarios en donde se disgregan un órgano o tejido completo, o bien se separan por diferentes métodos los tipos celulares selectivamente. Una gran variedad de aplicaciones continúan de manera extensiva requiriendo de cultivos primarios, pero existe además la opción de cultivos de líneas de diferentes tipos celulares y de diferentes grupos de organismos (insectos, aves y mamíferos principalmente).
- Cultivo de explantes: Se coloca un fragmento de tejido o de órgano en la interfase sólido-líquido de un soporte de vidrio o de plástico. Las células se adhieren a la superficie y las células de la periferia del explante pueden migrar y proliferar por la superficie del soporte.
- Cultivo celular primario: Es el tipo de cultivo más utilizado. Se puede obtener a partir de explantes primarios o de suspensiones de células disgregadas. La disgregación celular se realiza por métodos enzimáticos o mecánicos. En estos cultivos se pierden las interacciones célula-célula y las interacciones de la célula con la matriz extracelular. Sin embargo, las células son capaces de proliferar y la población celular crece notablemente. Cuando las células ocupan toda la superficie disponible se dice que han alcanzado la confluencia. En esta etapa, las células establecen contactos entre ellas que inhiben su proliferación y el crecimiento se detiene. Por eso, al cabo de un tiempo hay que transplantar las células a un nuevo soporte. Esta operación se denomina subcultivo o pase.
Existen dos tipos de cultivo celular primario:
• Cultivos en monocapa: las células crecen adheridas sobre un soporte sólido (plástico o vidrio). El anclaje al sustrato es un prerrequisito para la proliferación celular. Es el método utilizado para la mayoría de las células excepto para las hematopoyéticas.
• Cultivos en suspensión: las células se encuentran dispersas en el medio de cultivo. Su crecimiento no depende del anclaje. Este tipo de cultivo se restringe a las células hematopoyéticas, células madre, líneas celulares transformadas y células tumorales. Alcanzan la confluencia cuando el número de células es grande y los nutrientes son insuficientes.
Requerimientos celulares.
Temperatura [25oC (artrópodos), 33oC (células epiteliales), 36-38oC (otros)].
pH (7.2 – 7.4 la mayoría, 6.6 – 8.0 otros).
Nutrientes (aminoácidos, vitaminas, sales inorgánicas, coenzimas, ácidos nucleicos, etc.)
Indicadores de pH (Por ejemplo: Rojo de fenol)
Antibióticos (estreptomicina, Penicilina, Anfotericina B, etc.)
Gases (O2, CO2)
Sustancias enriquecedoras (suero de caballo, plasma líquido, Extractos de tejidos, etc.)
Pase o subcultivo.
El pase de las células supone transferir un pequeño número de células a un nuevo medio. Las células pueden cultivarse más tiempo si se pasan regularmente, ya que así se evita la senescencia asociada a situaciones prolongadas de alta densidad celular. Con cultivos en suspensión el pase se hace fácilmente, tomando una pequeña cantidad de cultivo que contenga unas pocas células y diluyéndola en un volumen mayor de medio fresco. En cultivos adherentes, las células han de ser inicialmente despegadas; esto se efectúa comúnmente con una mezcla de tripsina y EDTA, aunque actualmente existen otras mezclas de enzimas para esto.
Infección.
Los cambios celulares producidos por la infección viral son un importante criterio de diagnóstico a evaluar, para poder precisar el tipo de agente infeccioso ante el cual se enfrenta un individuo, esto se debe gracias a los avances en el cultivo de células en el laboratorio.
EFECTO CITOPÁTICO: Se conoce como efecto citopático al aspecto macroscópico e histológico del daño producido por un virus en un cultivo celular el cual es un importante criterio de diagnóstico ya que muchos virus causan efectos citopáticos característicos.
Entre los cambios citopáticos en las células se encuentran los siguientes:
DEGENERACION: Se refiere a todas las lesiones causadas por los virus en el tejido afectado, este daño es causado por distintos factores como son la síntesis de proteínas toxicas por parte del virus dentro de la célula o por la acumulación de proteínas víricas que van a afectar la configuración original de la célula; el virus al sintetizar sus proteínas impide que la célula sinteticé sus proteínas estructurales lo que provoca la degeneración de esta hasta llegar a la muerte.
CORPÚSCULO: Un cambio característico de las células infectadas por virus es la formación de cuerpos de inclusión identificables por microscopia óptica con ayuda de tinciones . Dependiendo del virus estos cuerpos de inclusión pueden ser simples o múltiples, grandes o pequeños, redondos o irregulares, intranucleares o intracitoplasmáticos y acidofilos o basofilos; estos cuerpos de inclusión son formados por acumulación de viriones o de componentes virales como agregados cristalinos, es decir fábricas de virus donde los componentes virales están siendo sintetizados; estos cuerpos de inclusión también pueden ser causados por agentes químicos y bacterias. Ejemplo:(cuerpos de negri- virus de la rabia).
FUSIÓN CELULAR: Es una característica de la infección de monocapas celulares por paramixovirus, herpesvirus, coronavirus y poxvirus es la formación de sincitios también llamados policariocitos o células gigantes, esto se da por cambios en la membrana celular que determinan la fusión de las células infectadas con las células vecinas no infectadas.
INCORPORACION DE ANTIGENOS A LA MEMBRANA PLASMÁTICA: En muchas infecciones víricas se insertan proteínas codificadas por el virus en la membrana plasmática de las células infectadas por virus RNA como por ejemplo: influenza, paramixovirus y togavirus. Estas glicoproteínas víricas no se insertan al azar en la membrana si no que indican el lugar en el que ha de madurar el virus.
Estos antígenos en la membrana constituyen la diana para los mecanismos inmunitarios específicos del organismo los cuales pueden destruir la célula antes de que se produzca un número significativo de nuevos viriones.
MUERTE CELULAR: El evento terminal de muchas relaciones virus- célula es la muerte celular causado por virus citocidas, la apariencia del daño producido en los cultivos celulares es utilizado como criterio de diagnóstico; la muerte celular puede ser causada por la suspensión de la síntesis del ARN y de las proteínas del huésped lo que es incompatible con la vida de este, otra causa puede ser el acumulo de proteínas virales toxicas para la célula como las proteínas de la cápside, las proteínas de viriones se congregan en grandes cristales agregados o en inclusiones que distorsionan a la célula, otra causa es que las células infectadas se hinchan bastante lo que provoca cambios en la permeabilidad de la membrana, eventualmente las enzimas de los lisosomas de la célula se derraman en el citoplasma dando lugar a la digestión autolítica de la célula.
INFECCIÓN ABORTIVA: Es cuando no ocurre síntesis de descendencia infecciosa de un virus y tal hecho puede depender de 1) la intolerancia de una célula intrínsecamente incapaz de soportar el crecimiento de un virus en particular, 2) a la incapacidad intrínseca de en virus para replicarse en una célula, por otra parte tolerante, 3) puede depender de la presencia de un virus incompleto o defectuoso.
INFECCIÓN VIRAL PERSISTENTE: Es cuando el virus permanece en la célula infectada durante un periodo prolongado sin signos visibles de efecto citopático y apenas sin alteración del metabolismo y multiplicación de células infectadas, suele observarse infección viral en paramixotoga, radboarena y retrovirus; y entre los mecanismos de persistencia tenemos los siguientes; 1) el virus puede ser no citopático lo que resulta en la multiplicación de la célula y el virus; 2) la presencia de un gran número de partículas de interferencia reduciendo la replicación del virión por lo que la célula no es destruida; 3) mutantes sensibles a la temperatura que difícilmente se replican a 37`grados manteniendo la infección; 4) la producción de interferón por parte de la célula que inhibe la multiplicación viral y evita la destrucción celular; 5) más células resistentes que susceptibles lo que establece una infección persistente en el cultivo.
TRANSFORMACIÓN CELULAR POR VIRUS CON ADN: Buena parte de los virus de DNA que forman tumores son oncogénicos en condiciones de laboratorio, pero usualmente no producen tumores malignos en sus huéspedes naturales, en los cuales causan una enfermedad leve o inaparente. Entre estos virus encontramos a los papovavirus, adenovirus, y poxvirus.
TRANSFORMACIÓN CELULAR POR VIRUS CON ARN: Solo un pequeño número de virus con ARN han sido asociados en forma inequívoca con la formación de enfermedades neoplásicas en condiciones naturales todos estos pertenecientes a una sola familia, la de los retrovirus.
Congelamiento.
Es importante disponer de alícuotas congeladas de las células con el fin de minimizar la acumulación de cambios genéticos en las líneas continuas, evitar la senescencia y la transformación en las líneas finitas, y evitar la pérdida accidental de una línea por muerte o contaminación. En la actualidad el mejor método de almacenamiento es la congelación en nitrógeno líquido. Las células crecidas hasta un 70-80% de confluencia (fase logarítmica del cultivo) se resuspenden. La suspensión celular, idealmente de alta concentración celular, debe ser congelada lentamente (descenso de aproximadamente 1ºC/min) en presencia de un agente preservante como el glicerol o el dimetilsulfóxido (DMSO). Las células son transferidas rápidamente a nitrógeno líquido (-196ºC) cuando alcanzan una temperatura inferior a -50ºC, esto se consigue introduciendo los tubos con las células en un recipiente especial con propanol, e introduciéndolo primero en el congelador de -80ºC.
Hasta llegar a -80ºC, la temperatura debe bajar lentamente para evitar la formación de cristales intracelulares que puedan dañar a las células. En el nitrógeno líquido se almacenan sumergidas o en la fase gaseosa superior durante largos periodos de tiempo (años) sin deterioro celular apreciable. El almacenamiento a temperaturas tan bajas como -80ºC es posible aunque se detecta deterioro de las células a las pocas semanas y/o meses.
Las bajas temperaturas afectan la difusión y ósmosis a través de las membranas. El objetivo de la criopreservación es mantener la viabilidad y funcionalidad celular. Este se consigue porque el frio enlentece las reacciones enzimáticas que se producen dentro de las células.
Los periodos críticos para la sobrevida celular durante la criopreservación son la fase inicial del congelamiento y el periodo de retorno a las condiciones fisiológicas normales, por ello la descongelación de los stocks se ha de realizar rápidamente, diluyendo la suspensión y eliminando el agente preservante con la máxima rapidez. La membrana celular es la estructura que sufre mayor daño en la congelación, esto es debido a la pérdida de fluidez de los componentes lipídicos, dando un alto grado de fragilidad celular. La lesión celular crioinducida se explica en función de la formación de hielo intracelular y del estrés osmótico al que se ven inducidas durante la congelación. Existen muchas soluciones de congelación de células. Se recomienda el uso de 10% DMSO en suero bovino fetal (FBS), aunque algunas líneas continuas se congelan con la misma eficacia en 10% DMSO en medio completo (usualmente DMEM 10% FCS). Otros tipos celulares como los hepatocitos se congelan bien en soluciones de sales de alginato.
TIPOS DE SOLUCIONES DE CONGELACIÓN
PERMEABLES O INTRACELULARES: De bajo peso molecular, Glicerol (G), Dimetilsulfóxido (DMSO), 1- propanodiol, etilenglicol (EG), propilenglicol (PG), polietilenglicol (PEG), etanol y otros alcoholes; todos estos compuestos deshidratan la célula penetrando a ésta para ayudar a proteger el citoplasma. Es más usado es el DMSO, que es un solvente bipolar, hidrosoluble, de bajo peso molecular. Su acción se atribuye principalmente a la habilidad de prevenir la acumulación excesiva de electrolitos y otras sustancias durante el proceso de congelación, y la formación de cristales de hielo que rompen la estructura de la membrana, su bajo peso molecular permite la entrada rápida a través de la membrana celular.
IMPERMEABLES O EXTRACELULARES: De alto peso molecular efectivas a velocidades altas de congelación, son importantes por ejercer su acción crioprotectora promoviendo la rápida deshidratación celular y suelen usarse asociadas a los agentes penetrantes. Son: glucosa, fructosa, ficol, dextrano sorbitol, sucrosa, lactosa, trealosa, rafinosa y otros azucares, estos compuestos extraen el agua libre intracelular utilizando la diferencia de presión osmótica sin penetrar a la célula; son efectivos para preservar la funcionalidad y estructura de las membranas a baja actividad de agua.
Los crioprotectores evitan el daño celular:
1º- Inhibiendo la formación de cristales intracelulares.
2º- Disminuyendo el gradiente osmótico.
3º- Aumentando la formación de cristales extracelulares, formando un caparazón.
Descongelación.
Podemos clasificar los distintos métodos, de acuerdo a la velocidad de congelación y descongelación en protocolos de congelación lenta-descongelación lenta, congelación lenta-descongelación rápida (esta es la más usada). La descongelación de las células debe de ser muy rápida, puesto que esto previene la formación de cristales en el momento en que la temperatura baja de -50ºC a 0ºC, si el proceso se lleva a cabo lentamente causa daño celular y pérdida de viabilidad. Según saquemos las células del nitrógeno líquido, lo que debemos hacer es introducirlas en el baño a 37ºC, para que se descongelen lo antes posible. Una vez descongeladas las re - suspendemos en un tubo de centrífuga con medio de cultivo, mínimo 9 ml, para conseguir que el DMSO quede reducido a una concentración de un 1%, esto se realiza para lavarlas bien, y eliminar en el primer lavado la mayor cantidad posible de DMSO, ya que este daña las células. Las centrifugamos durante 10 minutos a 450G. Se quita el sobrenadante y se re - suspende el pellet, luego se siembran todas en un flask de 75 cm2, aunque antes de sembrarlas se pueden volver a lavar. Cambiarlas el medio al día siguiente para quitar los posibles restos de DMSO que puedan quedar.
Referencias Bibliográficas
I. Conservación de células congeladas. Congelación y descongelación. Consultado en web el 06/12/15. Disponible en: http://paginadeltel.es.tl/Congelaci%F3n-y-descongelaci%F3n-de-C-e2-lulas-.-.htm
II. Cultivos celulares. Consultado en Web, el 06/12/15. Disponible en: http://www.ibt.unam.mx/embrion/002.Docencia/002.B.FolderTutoriales/TutorialBioDes/P%87ginasTutorialBioDes/1.1BioDes.Introduccion.html
TIPOS DE SOLUCIONES DE CONGELACIÓN
PERMEABLES O INTRACELULARES: De bajo peso molecular, Glicerol (G), Dimetilsulfóxido (DMSO), 1- propanodiol, etilenglicol (EG), propilenglicol (PG), polietilenglicol (PEG), etanol y otros alcoholes; todos estos compuestos deshidratan la célula penetrando a ésta para ayudar a proteger el citoplasma. Es más usado es el DMSO, que es un solvente bipolar, hidrosoluble, de bajo peso molecular. Su acción se atribuye principalmente a la habilidad de prevenir la acumulación excesiva de electrolitos y otras sustancias durante el proceso de congelación, y la formación de cristales de hielo que rompen la estructura de la membrana, su bajo peso molecular permite la entrada rápida a través de la membrana celular.
IMPERMEABLES O EXTRACELULARES: De alto peso molecular efectivas a velocidades altas de congelación, son importantes por ejercer su acción crioprotectora promoviendo la rápida deshidratación celular y suelen usarse asociadas a los agentes penetrantes. Son: glucosa, fructosa, ficol, dextrano sorbitol, sucrosa, lactosa, trealosa, rafinosa y otros azucares, estos compuestos extraen el agua libre intracelular utilizando la diferencia de presión osmótica sin penetrar a la célula; son efectivos para preservar la funcionalidad y estructura de las membranas a baja actividad de agua.
Los crioprotectores evitan el daño celular:
1º- Inhibiendo la formación de cristales intracelulares.
2º- Disminuyendo el gradiente osmótico.
3º- Aumentando la formación de cristales extracelulares, formando un caparazón.
Descongelación.
Podemos clasificar los distintos métodos, de acuerdo a la velocidad de congelación y descongelación en protocolos de congelación lenta-descongelación lenta, congelación lenta-descongelación rápida (esta es la más usada). La descongelación de las células debe de ser muy rápida, puesto que esto previene la formación de cristales en el momento en que la temperatura baja de -50ºC a 0ºC, si el proceso se lleva a cabo lentamente causa daño celular y pérdida de viabilidad. Según saquemos las células del nitrógeno líquido, lo que debemos hacer es introducirlas en el baño a 37ºC, para que se descongelen lo antes posible. Una vez descongeladas las re - suspendemos en un tubo de centrífuga con medio de cultivo, mínimo 9 ml, para conseguir que el DMSO quede reducido a una concentración de un 1%, esto se realiza para lavarlas bien, y eliminar en el primer lavado la mayor cantidad posible de DMSO, ya que este daña las células. Las centrifugamos durante 10 minutos a 450G. Se quita el sobrenadante y se re - suspende el pellet, luego se siembran todas en un flask de 75 cm2, aunque antes de sembrarlas se pueden volver a lavar. Cambiarlas el medio al día siguiente para quitar los posibles restos de DMSO que puedan quedar.
Referencias Bibliográficas
I. Conservación de células congeladas. Congelación y descongelación. Consultado en web el 06/12/15. Disponible en: http://paginadeltel.es.tl/Congelaci%F3n-y-descongelaci%F3n-de-C-e2-lulas-.-.htm
II. Cultivos celulares. Consultado en Web, el 06/12/15. Disponible en: http://www.ibt.unam.mx/embrion/002.Docencia/002.B.FolderTutoriales/TutorialBioDes/P%87ginasTutorialBioDes/1.1BioDes.Introduccion.html
