Determinación de proteínas totales, albúmina.

Cultivo celular

Se le llama cultivo celular al proceso mediante el cual las células, ya sean eucariotas o procariotas, pueden cultivarse en condiciones controladas. Dicho de otra manera, es un conjunto de técnicas que nos permiten mantener células in vitro con una gran aproximación a sus propiedades y funciones in vivo.

En la práctica el término "cultivo celular" se usa normalmente en referencia al cultivo de células aisladas de eucariotas pluricelulares, especialmente células animales.

El desarrollo histórico y metodológico del cultivo celular está íntimamente ligado a los péptidos cultivares del cultivo de tejidos y el cultivo de órganos.

El cultivo de células animales empezó a ser una técnica rutinaria de laboratorio durante los años 50, pero el concepto de mantener líneas de células vivas separadas del tejido de origen fue descubierto en el siglo XIX.

El fisiólogo inglés Sydney Ringer desarrolló a finales del siglo XIX una solución salina, conocida como solución de Ringer, que contiene cloruro de sodio, potasio, calcio y magnesio, dicha solución es capaz de mantener latiendo el corazón de un animal fuera del cuerpo.

En 1885 Wilhelm Roux extrajo una porción de la médula de embrión de pollo y la mantuvo varios 

días en cultivo en una solución salina tibia, estableciendo el principio de los cultivos tisulares. Ross Granville Harrison, trabajando en la Escuela de Medicina de la Universidad Johns Hopkins y más tarde en la Universidad de Yale, estableció la metodología del cultivo tisular en una serie de trabajos publicados entre 1908 y 1910.

Las técnicas de cultivo celular avanzaron significativamente en los 40 y 50, como soporte a la investigación en virología. La utilización de cultivos celulares para producir virus permitió preparar virus purificados para ser utilizados en vacunas. La vacuna Salk de la polio fue una de los primeros productos producidos en masa usando técnicas de cultivos celulares. Esta vacuna fue posible gracias a la investigación de John Franklin Enders, Thomas Huckle Weller y Frederick Chapman Robbins, quienes fueron galardonados con el Premio Nobel por el descubrimiento de un método de crecimiento de virus en cultivos celulares de riñón de mono.

Clasificación

Existen diferentes tipos de cultivos, y el término "cultivo de tejidos" es el nombre genérico para incluir tanto el cultivo de órganos como el cultivo de células.

- Cultivo de órganos. Este grupo de técnicas comprende el cultivo de órganos completos con la intensión de preservar la estructura histológica tridimensional original de donde fueron disecados. Generalmente se cultivan órganos embrionarios, cuyo objetivo principal es el estudio de los mecanismos que controlan su desarrollo, sin embargo en años recientes se ha iniciado el cultivo de órganos "adultos" reconstruidos principalmente para substituir la necesidad de obtenerlos a partir de donadores en el transplante de órganos. Un tipo especial de cultivos reconstituidos es el histotípico, en donde se disgrega el tejido original por tratamientos generalmente enzimáticos y se reasocian las células para recrear in vitro la estructura tridimensional del órgano que le dio origen. Existe un tipo especial de cultivo histotípico denominado organotípico en donde se reasocian células de diferentes linajes. Este tipo de cultivos sirve para analizar las interacciones intercelulares necesarias para que se reorganicen estructuralmente los órganos, o para analizar el comportamiento de las células que los componen (diferenciación, migración, proliferación, muerte y envejecimiento).

- Cultivo de células. Este tipo de cultivos se inician a partir de cultivos primarios en donde se disgregan un órgano o tejido completo, o bien se separan por diferentes métodos los tipos celulares selectivamente. Una gran variedad de aplicaciones continúan de manera extensiva requiriendo de cultivos primarios, pero existe además la opción de cultivos de líneas de diferentes tipos celulares y de diferentes grupos de organismos (insectos, aves y mamíferos principalmente).

- Cultivo de explantes: Se coloca un fragmento de tejido o de órgano en la interfase sólido-líquido de un soporte de vidrio o de plástico. Las células se adhieren a la superficie y las células de la periferia del explante pueden migrar y proliferar por la superficie del soporte.

- Cultivo celular primario: Es el tipo de cultivo más utilizado. Se puede obtener a partir de explantes primarios o de suspensiones de células disgregadas. La disgregación celular se realiza por métodos enzimáticos o mecánicos. En estos cultivos se pierden las interacciones célula-célula y las interacciones de la célula con la matriz extracelular. Sin embargo, las células son capaces de proliferar y la población celular crece notablemente. Cuando las células ocupan toda la superficie disponible se dice que han alcanzado la confluencia. En esta etapa, las células establecen contactos entre ellas que inhiben su proliferación y el crecimiento se detiene. Por eso, al cabo de un tiempo hay que transplantar las células a un nuevo soporte. Esta operación se denomina subcultivo o pase.

Existen dos tipos de cultivo celular primario:

• Cultivos en monocapa: las células crecen adheridas sobre un soporte sólido (plástico o vidrio). El anclaje al sustrato es un prerrequisito para la proliferación celular. Es el método utilizado para la mayoría de las células excepto para las hematopoyéticas.

• Cultivos en suspensión: las células se encuentran dispersas en el medio de cultivo. Su crecimiento no depende del anclaje. Este tipo de cultivo se restringe a las células hematopoyéticas, células madre, líneas celulares transformadas y células tumorales. Alcanzan la confluencia cuando el número de células es grande y los nutrientes son insuficientes.

Requerimientos celulares.

 Temperatura [25oC (artrópodos), 33oC (células epiteliales), 36-38oC (otros)].

 pH (7.2 – 7.4 la mayoría, 6.6 – 8.0 otros).

 Nutrientes (aminoácidos, vitaminas, sales inorgánicas, coenzimas, ácidos nucleicos, etc.)

 Indicadores de pH (Por ejemplo: Rojo de fenol)

 Antibióticos (estreptomicina, Penicilina, Anfotericina B, etc.)

 Gases (O2, CO2)

 Sustancias enriquecedoras (suero de caballo, plasma líquido, Extractos de tejidos, etc.)

Pase o subcultivo.

El pase de las células supone transferir un pequeño número de células a un nuevo medio. Las células pueden cultivarse más tiempo si se pasan regularmente, ya que así se evita la senescencia asociada a situaciones prolongadas de alta densidad celular. Con cultivos en suspensión el pase se hace fácilmente, tomando una pequeña cantidad de cultivo que contenga unas pocas células y diluyéndola en un volumen mayor de medio fresco. En cultivos adherentes, las células han de ser inicialmente despegadas; esto se efectúa comúnmente con una mezcla de tripsina y EDTA, aunque actualmente existen otras mezclas de enzimas para esto.

Infección.

Los cambios celulares producidos por la infección viral son un importante criterio de diagnóstico a evaluar, para poder precisar el tipo de agente infeccioso ante el cual se enfrenta un individuo, esto se debe gracias a los avances en el cultivo de células en el laboratorio.

EFECTO CITOPÁTICO: Se conoce como efecto citopático al aspecto macroscópico e histológico del daño producido por un virus en un cultivo celular el cual es un importante criterio de diagnóstico ya que muchos virus causan efectos citopáticos característicos.

Entre los cambios citopáticos en las células se encuentran los siguientes:

DEGENERACION: Se refiere a todas las lesiones causadas por los virus en el tejido afectado, este daño es causado por distintos factores como son la síntesis de proteínas toxicas por parte del virus dentro de la célula o por la acumulación de proteínas víricas que van a afectar la configuración original de la célula; el virus al sintetizar sus proteínas impide que la célula sinteticé sus proteínas estructurales lo que provoca la degeneración de esta hasta llegar a la muerte.

CORPÚSCULO: Un cambio característico de las células infectadas por virus es la formación de cuerpos de inclusión identificables por microscopia óptica con ayuda de tinciones . Dependiendo del virus estos cuerpos de inclusión pueden ser simples o múltiples, grandes o pequeños, redondos o irregulares, intranucleares o intracitoplasmáticos y acidofilos o basofilos; estos cuerpos de inclusión son formados por acumulación de viriones o de componentes virales como agregados cristalinos, es decir fábricas de virus donde los componentes virales están siendo sintetizados; estos cuerpos de inclusión también pueden ser causados por agentes químicos y bacterias. Ejemplo:(cuerpos de negri- virus de la rabia).

FUSIÓN CELULAR: Es una característica de la infección de monocapas celulares por paramixovirus, herpesvirus, coronavirus y poxvirus es la formación de sincitios también llamados policariocitos o células gigantes, esto se da por cambios en la membrana celular que determinan la fusión de las células infectadas con las células vecinas no infectadas.

INCORPORACION DE ANTIGENOS A LA MEMBRANA PLASMÁTICA: En muchas infecciones víricas se insertan proteínas codificadas por el virus en la membrana plasmática de las células infectadas por virus RNA como por ejemplo: influenza, paramixovirus y togavirus. Estas glicoproteínas víricas no se insertan al azar en la membrana si no que indican el lugar en el que ha de madurar el virus.

Estos antígenos en la membrana constituyen la diana para los mecanismos inmunitarios específicos del organismo los cuales pueden destruir la célula antes de que se produzca un número significativo de nuevos viriones.

MUERTE CELULAR: El evento terminal de muchas relaciones virus- célula es la muerte celular causado por virus citocidas, la apariencia del daño producido en los cultivos celulares es utilizado como criterio de diagnóstico; la muerte celular puede ser causada por la suspensión de la síntesis del ARN y de las proteínas del huésped lo que es incompatible con la vida de este, otra causa puede ser el acumulo de proteínas virales toxicas para la célula como las proteínas de la cápside, las proteínas de viriones se congregan en grandes cristales agregados o en inclusiones que distorsionan a la célula, otra causa es que las células infectadas se hinchan bastante lo que provoca cambios en la permeabilidad de la membrana, eventualmente las enzimas de los lisosomas de la célula se derraman en el citoplasma dando lugar a la digestión autolítica de la célula.

INFECCIÓN ABORTIVA: Es cuando no ocurre síntesis de descendencia infecciosa de un virus y tal hecho puede depender de 1) la intolerancia de una célula intrínsecamente incapaz de soportar el crecimiento de un virus en particular, 2) a la incapacidad intrínseca de en virus para replicarse en una célula, por otra parte tolerante, 3) puede depender de la presencia de un virus incompleto o defectuoso.

INFECCIÓN VIRAL PERSISTENTE: Es cuando el virus permanece en la célula infectada durante un periodo prolongado sin signos visibles de efecto citopático y apenas sin alteración del metabolismo y multiplicación de células infectadas, suele observarse infección viral en paramixotoga, radboarena y retrovirus; y entre los mecanismos de persistencia tenemos los siguientes; 1) el virus puede ser no citopático lo que resulta en la multiplicación de la célula y el virus; 2) la presencia de un gran número de partículas de interferencia reduciendo la replicación del virión por lo que la célula no es destruida; 3) mutantes sensibles a la temperatura que difícilmente se replican a 37`grados manteniendo la infección; 4) la producción de interferón por parte de la célula que inhibe la multiplicación viral y evita la destrucción celular; 5) más células resistentes que susceptibles lo que establece una infección persistente en el cultivo.

TRANSFORMACIÓN CELULAR POR VIRUS CON ADN: Buena parte de los virus de DNA que forman tumores son oncogénicos en condiciones de laboratorio, pero usualmente no producen tumores malignos en sus huéspedes naturales, en los cuales causan una enfermedad leve o inaparente. Entre estos virus encontramos a los papovavirus, adenovirus, y poxvirus.

TRANSFORMACIÓN CELULAR POR VIRUS CON ARN: Solo un pequeño número de virus con ARN han sido asociados en forma inequívoca con la formación de enfermedades neoplásicas en condiciones naturales todos estos pertenecientes a una sola familia, la de los retrovirus.

Congelamiento.

Es importante disponer de alícuotas congeladas de las células con el fin de minimizar la acumulación de cambios genéticos en las líneas continuas, evitar la senescencia y la transformación en las líneas finitas, y evitar la pérdida accidental de una línea por muerte o contaminación. En la actualidad el mejor método de almacenamiento es la congelación en nitrógeno líquido. Las células crecidas hasta un 70-80% de confluencia (fase logarítmica del cultivo) se resuspenden. La suspensión celular, idealmente de alta concentración celular, debe ser congelada lentamente (descenso de aproximadamente 1ºC/min) en presencia de un agente preservante como el glicerol o el dimetilsulfóxido (DMSO). Las células son transferidas rápidamente a nitrógeno líquido (-196ºC) cuando alcanzan una temperatura inferior a -50ºC, esto se consigue introduciendo los tubos con las células en un recipiente especial con propanol, e introduciéndolo primero en el congelador de -80ºC. 

Hasta llegar a -80ºC, la temperatura debe bajar lentamente para evitar la formación de cristales intracelulares que puedan dañar a las células. En el nitrógeno líquido se almacenan sumergidas o en la fase gaseosa superior durante largos periodos de tiempo (años) sin deterioro celular apreciable. El almacenamiento a temperaturas tan bajas como -80ºC es posible aunque se detecta deterioro de las células a las pocas semanas y/o meses.

Las bajas temperaturas afectan la difusión y ósmosis a través de las membranas. El objetivo de la criopreservación es mantener la viabilidad y funcionalidad celular. Este se consigue porque el frio enlentece las reacciones enzimáticas que se producen dentro de las células.

Los periodos críticos para la sobrevida celular durante la criopreservación son la fase inicial del congelamiento y el periodo de retorno a las condiciones fisiológicas normales, por ello la descongelación de los stocks se ha de realizar rápidamente, diluyendo la suspensión y eliminando el agente preservante con la máxima rapidez. La membrana celular es la estructura que sufre mayor daño en la congelación, esto es debido a la pérdida de fluidez de los componentes lipídicos, dando un alto grado de fragilidad celular. La lesión celular crioinducida se explica en función de la formación de hielo intracelular y del estrés osmótico al que se ven inducidas durante la congelación. Existen muchas soluciones de congelación de células. Se recomienda el uso de 10% DMSO en suero bovino fetal (FBS), aunque algunas líneas continuas se congelan con la misma eficacia en 10% DMSO en medio completo (usualmente DMEM 10% FCS). Otros tipos celulares como los hepatocitos se congelan bien en soluciones de sales de alginato.

TIPOS DE SOLUCIONES DE CONGELACIÓN 
 PERMEABLES O INTRACELULARES: De bajo peso molecular, Glicerol (G), Dimetilsulfóxido (DMSO), 1- propanodiol, etilenglicol (EG), propilenglicol (PG), polietilenglicol (PEG), etanol y otros alcoholes; todos estos compuestos deshidratan la célula penetrando a ésta para ayudar a proteger el citoplasma. Es más usado es el DMSO, que es un solvente bipolar, hidrosoluble, de bajo peso molecular. Su acción se atribuye principalmente a la habilidad de prevenir la acumulación excesiva de electrolitos y otras sustancias durante el proceso de congelación, y la formación de cristales de hielo que rompen la estructura de la membrana, su bajo peso molecular permite la entrada rápida a través de la membrana celular. 

 IMPERMEABLES O EXTRACELULARES: De alto peso molecular efectivas a velocidades altas de congelación, son importantes por ejercer su acción crioprotectora promoviendo la rápida deshidratación celular y suelen usarse asociadas a los agentes penetrantes. Son: glucosa, fructosa, ficol, dextrano sorbitol, sucrosa, lactosa, trealosa, rafinosa y otros azucares, estos compuestos extraen el agua libre intracelular utilizando la diferencia de presión osmótica sin penetrar a la célula; son efectivos para preservar la funcionalidad y estructura de las membranas a baja actividad de agua.

Los crioprotectores evitan el daño celular:
1º- Inhibiendo la formación de cristales intracelulares. 
2º- Disminuyendo el gradiente osmótico. 
3º- Aumentando la formación de cristales extracelulares, formando un caparazón.

Descongelación.
Podemos clasificar los distintos métodos, de acuerdo a la velocidad de congelación y descongelación en protocolos de congelación lenta-descongelación lenta, congelación lenta-descongelación rápida (esta es la más usada). La descongelación de las células debe de ser muy rápida, puesto que esto previene la formación de cristales en el momento en que la temperatura baja de -50ºC a 0ºC, si el proceso se lleva a cabo lentamente causa daño celular y pérdida de viabilidad. Según saquemos las células del nitrógeno líquido, lo que debemos hacer es introducirlas en el baño a 37ºC, para que se descongelen lo antes posible. Una vez descongeladas las re - suspendemos en un tubo de centrífuga con medio de cultivo, mínimo 9 ml, para conseguir que el DMSO quede reducido a una concentración de un 1%, esto se realiza para lavarlas bien, y eliminar en el primer lavado la mayor cantidad posible de DMSO, ya que este daña las células. Las centrifugamos durante 10 minutos a 450G. Se quita el sobrenadante y se re - suspende el pellet, luego se siembran todas en un flask de 75 cm2, aunque antes de sembrarlas se pueden volver a lavar. Cambiarlas el medio al día siguiente para quitar los posibles restos de DMSO que puedan quedar.

Referencias Bibliográficas
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Huevos embrionados

El embrión de pollo es uno de los medios más favorables para el aislamiento de algunos virus. Los huevos embrionados pueden ser inoculados por varias vías y su elección depende del virus que se quiera estudiar.
Los virus sólo pueden reproducirse en determinadas partes del embrión; por consiguiente, se deben inyectar en la región apropiada, P. ej. los mixovirus crecen bien en la membrana corioalantoidea, en tanto que el virus de la parotiditis prefiere la cavidad alantoidea. La infección puede producir una lesión tisular local conocida como pústula, cuyo aspecto, a menudo, es característico del virus.

Edad, vías de inoculación, dosis, efectos.
Desarrollo:
A. Inició de la organogénesis a las 48 horas de incubación.
B. La elipse representa el embrión dentro de los anexos embrionarios a los 3 días de incubación.
C. Muestra el desarrollo embrionario a los 4 días de incubación.
D. Desarrollo a los 5 días.
E. Los días 7 al 13 son los mejores días para la inoculación.

Desarrollo embrionario del pollo

Vías de Inoculación

 Cavidad Amniótica: el material inoculado ingresará en el embrión vía bucal y respiratoria, pudiéndose multiplicar en cualquier tejido de éste. El embrión debe ser de 10-14 días de edad. Se desinfecta el extremo del huevo que posee la cámara de aire y allí se perforará con un trócar o taladro adecuado. Con una aguja de 4,5 cm. de largo, orientada hacia la sombra del embrión se inocula 0,1-0,2 ml de material. Sellar el orificio con parafina fundida u otro sellador no tóxico.

 Membrana corioalantoidea: Usada para virus que producen placas, lesiones herpéticas. Los embriones deben ser de 10-12 días de edad. Se marca el punto de inoculación en el costado del huevo donde se observa buena irrigación de la membrana. Como es necesario hacer caer la membrana para obtener una buena superficie, se desinfecta el extremo del huevo que posee la cámara de aire y el punto de inoculación. Con sumo cuidado se perfora la cáscara y la membrana de la misma en el punto de inoculación y se hace un orificio en la cámara de aire por donde se succiona con una perilla de goma para que se produzca una falsa cámara de aire. Allí se depositará el inóculo de 0,1 - 0,2 ml con jeringa y aguja de tuberculina. Sellar los orificios con parafina fundida u otro sellador no tóxico.

 Cavidad alantoidea: el virus se difundirá en el fluido e infectará las células ectodérmicas de la membrana. Se utilizan embriones de 10-11 días de edad, Observándose el ovoscopio, se marca en el extremo de la cámara de aire, el punto de inoculación que debe ser opuesto a la ubicación del embrión y con pocos vasos sanguíneos. Se desinfecta y se perfora la cáscara en dicho punto, inoculando (0,1-0,2 ml) con una aguja de 1,5 cm de largo que se introduce paralela a la pared del huevo. Se sella con parafina fundida u otro sellador no tóxico.

 Saco vitelino: se emplean embriones de 8-12 días de edad con gran saco vitelino, Se desinfecta el extremo de la cámara de aire y se perfora la cáscara. Con una aguja en línea recta (0,1 - 0,2 ml.). Se sella con parafina líquida u otro sellador no tóxico.

 Endovenosa: se emplean embriones de 8-12 días de edad. Observándose al ovoscopio se selecciona una vena de buen grosor y que se dirija hacia el embrión. Se dibuja en la cáscara su ubicación. Usando un taladro adecuado se marca un rectángulo, enmarcando la vena y que sólo interese la cáscara, sin romper la membrana que se encuentra por debajo de ésta. Se desinfecta la zona y con una aguja bien fina se inocula (debe observarse cómo el inóculo al diluir la sangre, circula por la vena). Se sella con parafina fundida u otro sellador no tóxico.

Vías de inoculación del embrión de pollo

Indicadores de infección 

Deben examinarse inmediatamente después de muerto para evitar interferencias, es recomendable el enfriamiento previo a su apertura. 

 Cuerpos de inclusión 

 Congestión de la epidermis 

 Retorcimiento y/o enanismo 

 Engrosamiento y/o fibrosis 

 Disminución del volumen del líquido amniótico 

 Engrosamiento y edema de la MCA 

 Lesiones postulares de la MCA 

 Desarrollo anormal de plumas y órganos. 

 Hemorragias subcutáneas.

Virus que utilizan en este sistema.

Referencias Bibliográficas

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Animales de laboratorio más utilizados en virología

Un animal de laboratorio se define como todo aquel individuo que tras ser sometido a un experimento o investigación revela resultados que se pueden analizar, confirmar y de esta forma ser veraces.

Son criados en condiciones especiales para luego ser sometidos a experimentos o análisis de laboratorio.

Su uso está regulado por la NOM - 062 – ZOO.

Los animales más utilizados en virología son los siguientes:

Variedades (singénicos, transgénicos, gnotobiontes, etc.)

Animales Axénicos: (del griego a-, privación, xenos, extraño). Son aquellos animales de laboratorio criados fuera de todo contacto bacteriano y desprovistos de gérmenes.

Los animales axénicos son el resultado del uso de sistemas cerrados estériles además de que son obtenidos por histerotomía (cesárea) o histerectomía aséptica. Estos animales no siempre se obtienen en la práctica, debido a los agentes transmitidos verticalmente.

Animales Gnotobióticos: Estos son los ratones axénicos que han sido inoculados intencionalmente con un cóctel de uno o más microorganismos no patógenos, todos los cuales son conocidos. De hecho, el término “Gnotobiótico” se deriva del griego, “gnotos” (conocidos) y “bios” (vida). A los ratones gnotobióticos se les refiere también como ratones con “microbiota definida”. Al igual que los ratones axénicos, ellos también deben ser mantenidos en aisladores y bajo estrictos protocolos que impiden su exposición a microorganismos que puedan colonizar su intestino y, posteriormente, causar una disbiosis. 

Libres de Patógenos Específicos (SPF): Se han convertido rápidamente en el estándar mínimo aceptado para la investigación y además están comenzando a ser exigidos por autoridades reguladoras como el status de los animales utilizados en las pruebas de evaluación de productos destinados para uso humano y veterinario. Son colonizados por una variedad desconocida de especies de microorganismos Sin embargo, son definidos como libres de uno o varios microorganismos (patógenos) específicos.

Animales convencionales: se consideran aquellos animales que se crían y se mantienen sin barreras sanitarias adecuadas para impedir la introducción de microorganismos (instalaciones abiertas), por lo que están sujetos a nuevas infecciones. En estas instalaciones no existe un patrón especial de flujo de personal y materiales, y existe una sola salida para la entrada y salida de los animales. Deben estar libres de toda evidencia de enfermedades infecciosas especialmente transmisibles al hombre, tanto en el examen clínico como post – mortem. Libres de: Salmonella spp y Shigella spp, etc. 

Animales singénicos: son aquellos organismos genéticamente idénticos.

Animales transgénicos: son animales que han sido modificados genéticamente, añadiendo genes foráneos de manera deliberada, para cambiar alguna característica del animal, sea para añadirle alguna funcionalidad o para bloquear la expresión de algún gen.

Referencias Bibliográficas

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Restricciones moleculares de la célula hospedadora

Referencias Bibliográficas

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Interacción virus - célula hospedadora

Las infecciones virales en células eucarióticas pueden ser clasificadas en: líticas, persistentes, latentes, transformantes y abortivas. En todos estos tipos de infección, el evento inicial consiste en la interacción entre el virus y el receptor correspondiente presente en la superficie de la célula, mediante un modelo llave – cerradura. Si una célula carece del receptor apropiado para un virus en particular; entonces es automáticamente resistente a la infección por ese tipo de virus.

Célula permisiva 

Es aquella célula que cuenta con el mejor receptor para un determinado virus por lo que la entrada del virión será mucho más probable. En estas células la disponibilidad enzimática, de moléculas y señales intracelulares son las indicadas para la replicación viral. Por lo tanto va sufrir el daño y manifiestan la patogenia.

Infección productiva Se da cuando la célula es permisiva y cuenta con todas las condiciones para permitir la adecuada replicación viral y se generan partículas infecciosas y completas.

Célula semi – permisiva

Es la célula que cuenta con un receptor afín para un determinado virus por lo que la entrada del virión será probable aunque no garantiza su replicación.

Infección poco productiva Se da cuando el virión logra la adherencia con la célula y quizá logra internalizar su material genético e integrarlo a su maquinaria celular pero no logra producir gran cantidad de viriones o estos no están completos o no son infecciosos.

Infección latente Se logra la adherencia, se logra la penetración del material genético del virus y la integración exitosa a la maquinaria celular pero no se producen viriones pero si copias del material genético que se almacenan en la célula hospedadora. Puede tratarse de una actividad regulada por el mismo virus (por ejemplo EBV, VIH, Varicela zóster, Herpes, etc.) o por el ciclo celular de la célula hospedadora.

Infección restrictiva Se pueda dar en interacciones entre una célula semi - permisiva o permisiva con el virus, pero las condiciones no son las óptimas para la replicación y aun así existe una baja producción de viriones que quizá sean infectivos.

Célula no permisiva

Son aquellas células que no permiten la producción de la progenie viral.

Infección abortiva

Es aquella donde no hay continuación con la infección viral, debido a que: 

o La célula no cuenta con el receptor para el virus. 

o No se encuentra la fase del ciclo celular. 

o No se encuentra su ambiente enzimático propicio. 

o Virión defectuoso.

Interacciones virales transformantes 

La interacción entre las células permisivas (con protooncogenes) y un virión que posee oncogenes y resulta la malignización de la célula hospedadora y una producción << infinita >> de viriones.

Referencias Bibliográficas

I. Conservación de células congeladas. Congelación y descongelación. Consultado en web el 06/12/15. Disponible en: http://paginadeltel.es.tl/Congelaci%F3n-y-descongelaci%F3n-de-C-e2-lulas-.-.htm

II. Cultivos celulares. Consultado en Web, el 06/12/15. Disponible en: http://www.ibt.unam.mx/embrion/002.Docencia/002.B.FolderTutoriales/TutorialBioDes/P%87ginasTutorialBioDes/1.1BioDes.Introduccion.html

III. Dr Sashi B. Mohanty / Virologia veterinaria / Editorial Interamericana / México D.F. / PAGS:47-60 Y 344-377 / CAPITILOS:3 Y 18

Estructura y clasificación de virus. Consultado en web, el 07/12/15. Disponible en: http://www.freewebs.com/mictlamp/Bio/lecturas/01_estructura_y_clasificacion%20de%20virus.pdf

V. Estructura de partículas virales. Consultado en Web el 07/12/15. Disponible en: https://docs.fajardo.inter.edu/Acad/ammorales/Microbiologia-Dra%20Morales/Shared%20Documents/Modulo%201.pdf

VI. Frank Fenner/ Virologia veterinaria / Editorial ACRIBIA, S.A. ZARAGOZA / España / pags:125-137 / capitulos 6 y 31

VII. Frank Fenner / Virologia Medica / Ediciones científicas La Prensa Medica Mexicana S.A,./ México pags:80-91 y 151-164 / capitulos:5,9 y 13

VIII. Interacciones entre virus y células. Consultado en Web, el 07/12/15. Disponible en: http://bibliotecadigital.ilce.edu.mx/sites/ciencia/volumen2/ciencia3/071/htm/sec_9.htm

Proteínas y enzimas virales - Envolturas virales

Si un virus posee membrana, también debe de tener una o más proteínas víricas que actúen como ligando para los receptores en la membrana de la célula huésped. Muchos virus codifican proteínas estructurales (aquellas que forman una partícula vírica madura (o virión)) y quizás una enzima que participa en la replicación del genoma viral. 

Otros virus pueden codificar muchas más proteínas, de las cuales la mayoría no está presente en la partícula madura pero sí participan de alguna manera en la replicación viral. 

Muchas proteínas son de carácter estructural, formando la envoltura viral y la cápside. 

Sin embargo, también hay proteínas virales no estructurales y proteínas virales reguladoras y accesorias.

Las proteínas virales presentan ciertas propiedades y son responsables de diversas funciones biológicas. Algunas de ellas corresponden a la infectividad, protección del genoma viral, actividad enzimática, capacidad patogénica, virulencia, inmunogenicidad y antigenicidad.

Por ejemplo proteínas como la fosfoproteína (P), la nucleoproteína (N), la proteína M, la glucoproteína (G) y la polimerasa (L).

Propiedades de las proteínas de superficie

Constituyen un mecanismo de protección del genoma contra la acción de las nucleasas bacterianas o tisulares.

Presentan afinidad con receptores celulares, participando de la adsorción y penetración del virus a la célula huésped, esta afinidad selectiva sería la que determine el tropismo del virus por determinados tejidos.

Poseen capacidad antigénica, induciendo en un huésped inmunocompetente; una respuesta inmune, mediada fundamentalmente por anticuerpos neutralizantes.

Genoma viral y mapas genéticos

El genoma viral es el conjunto de genes que pueden interpretarse como la totalidad de la información genética que posee un microorganismo (en este caso, de un virus).

Un mapa genético es la representación gráfica de los genes que forman su información genética, es decir, todo aquello que se va a expresar en el genoma.

Mapa genético del Papiloma virus tipo 16

Estructura del genoma del virus HIV

Componentes virales y nomenclatura

Estructura de las partículas virales

La estructura de un virus es simple, a pesar de esto existe cierta diversidad que es usada para la clasificación de estos microorganismos.

Ácido nucleico (ADN o ARN): Cualquiera de estos ácidos puede presentarse en forma monocatenaria o bicatenaria.

Cápside: cubierta proteica que rodea al ácido nucleico. Está formada por numerosas copias de una proteína (Capsómero), la cual pude ser helicoidal o icosaédrica. Protege al ácido nucleico de la desecación y de las enzimas tisulares. Además actúa como complejo antigénico, estimulando la respuesta inmune del huésped.

Envoltura: solo la presentan los “virus envueltos” está constituida por lipoproteínas de origen celular en la que se insertan glicoproteínas. Constituyen un mecanismo de protección del genoma contra la acción de las nucleasas bacterianas o tisulares.

Los virus pueden ser de tres tipos: Envueltos, desnudos y complejos.

Nomenclatura viral

Orden Viral: Agrupación de virus que comparten características comunes. Sufijo –virales.

Familia y subfamilia: Agrupación de géneros virales que comparten características comunes o distintas de otros miembros de otras familias. Sufijos –viridae o virinae, respectivamente.

Género Viral: Agrupación de especies que comparten características comunes o que son distintas que son distintas de otros miembros de otros géneros. Sufijo –virus

Especie viral: clase constituida de una forma de replicación con un nicho ecológico particular. Es la más importante de la clasificación jerárquica. El nombre va acompañado por la palabra virus.

Por ej: Familia: Herpesviridae, Subfamilia: Alfaherpesvirinae, género: simplexvirus, Herpes virus Humano 2.

 Los virus ADN de enfermedades humanas se dividen en 6 familias.

 Los virus ARN se dividen en 13 familias.

Referencias Bibliográficas

I. Conservación de células congeladas. Congelación y descongelación. Consultado en web el 06/12/15. Disponible en: http://paginadeltel.es.tl/Congelaci%F3n-y-descongelaci%F3n-de-C-e2-lulas-.-.htm

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VII. Frank Fenner / Virologia Medica / Ediciones científicas La Prensa Medica Mexicana S.A,./ México pags:80-91 y 151-164 / capitulos:5,9 y 13

VIII. Interacciones entre virus y células. Consultado en Web, el 07/12/15. Disponible en: http://bibliotecadigital.ilce.edu.mx/sites/ciencia/volumen2/ciencia3/071/htm/sec_9.htm

Clasificación de los virus

En 1962, André Lwoff, Robert Horne y Paul Tournier fueron los primeros en desarrollar una forma de clasificación de los virus, basada en el sistema jerárquico Linneano. Este sistema basa la clasificación en filos, clases, órdenes, familias, géneros y especies. De acuerdo a cuatro características.

I. Naturaleza de ácidos nucleicos presentes en el virión (estructura genómica).
II. Simetría de la cubierta proteica.
III. Presencia o ausencia de membrana lipídica (envoltura).
IV. Dimensiones del virión y cápside.

Clasificación según Levaditti
Por la forma de transmisión:
 Por vectores
 Por contacto
 Digestiva
 Aerógena
 Congénita
 Sexual

Por tropismo (afinidad por el tejido)
 Exantemáticos
 Respiratorios
 Digestivos o entéricos
 Renales
 Neurotrópicos
 Hepáticos

Clasificación según Cowdry

Todos los virus producen un daño celular al multiplicarse, que se llama efecto citopático, cicatriz, cúmulos, sincicios, etc.

Clasifica los virus según cómo se tiñen los cuerpos de inclusión que producen: Cuerpos de inclusión Cowdry A. Se tiñen con colorantes ácidos. Producen lesiones grandes que llegan a romper el núcleo de la célula eucariota.

Cuerpos de inclusión Cowdry B. Se tiñen con colorantes básicos. Producen lesiones pequeñas que no llegan a romper el núcleo, es menos deformante.

Casi siempre son intranucleares, aunque también pueden ser citoplasmáticos, como los corpúsculos de Negri (virus de la rabia canina).

Clasificación según al tipo de organismo que parasitan u hospedador en:
 Bacteriófagos o fagos: virus que parasitan a bacterias.
 Virus de animales (vertebrados e invertebrados).
 Virus vegetales.
 Virus eucariotas: algas, hongos, parasitos.
 Virus de insectos.

Clasificación según el ácido nucleico que posean:

En virus DNA y virus RNA, de doble hélice, hélice sencilla o mixto, en circular o lineal y en polaridad positiva o negativa.

Otras clasificaciones
 Según el número de capsómeros.
 Sensibilidad o resistencia al éter y al cloroformo (presencia o no de envoltura lipídica)
 Daño producido con los corpúsculos celulares.
 Estabilidad o labilidad a diferentes pH´s.

En la clasificación de las partículas virales se han tenido en cuenta características estructurales o funcionales, las propiedades del virión, las propiedades antigénicas, las propiedades biológicas y más recientemente las características genómicas.

Actualmente las dos clasificaciones más ampliamente usadas son la del Comité Internacional de Taxonomía de Virus (ICTV) y la clasificación de Baltimore (Tabla 1). Los cuatro grupos taxonómicos reconocidos por el ICTV son: orden, familia (algunos grupos tienen subfamilias), género, y especie.

En el VIII Reporte de Clasificación y Nomenclatura de 2005, existen más de 1938 especies de virus distribuidas en 3 órdenes, 73 familias, 9 subfamilias y 287 géneros.

Clasificación de Baltimore

El método de David Baltimore que agrupa las familias de virus según su estrategia de replicación incluye siete grupos donde se pueden encontrar virus con cadena doble o sencilla de DNA, cadena doble o sencilla de RNA (dsRNA), virus con RNA de cadena sencilla de sentido positivo que poseen el mismo sentido del mRNA o de sentido negativo cuyo sentido es opuesto al sentido del mRNA.

Esta clasificación de los virus se basa en el modo de replicación de los genes y su expresión. En ellos el RNAm juega un papel central, de modo que cada grupo de virus sigue el mismo camino para la síntesis del mRNA.

Drosophila melanogaster

 1. Menciona tres ventajas de la Drosophila melanogaster como modelo biológico

1. Entre las ventajas que se han señalado para su uso en el área de la investigación científica se destaca la facilidad para realizar cultivos experimentales, la corta duración de su ciclo de vida (ya que dura de 1O a 12 días a 25 °C), la distinción clara entre cada una de las fases de su ciclo de vida, se conocen la morfología larvaria, en donde las células que formarán parte de las distintas estructuras del cuerpo del adulto están alojadas en pequeños sacos conocidos como discos imaginales y la morfología de los adultos , presenta dimorfismo sexual claro, una sola pareja produce gran cantidad de descendencia, su mantenimiento requiere poco espacio y la elaboración del medio de cultivo es de costo reducido.
2. Drosophila melanogaster tiene un número cromosómico bajo (2n = 8), las larvas presentan cromosomas gigantes o politenicos en sus glándulas salivales, por lo que es de gran utilidad para estudiar la morfología cromosómica y la evolución cariotípica, además se han construido cromosomas balanceadores que evitan la recombinación de cromosomas específicos.
3. Posee complejos enzimáticos semejantes a los que se presentan en la fracción S9 del hígado de los mamíferos, por lo que se le ha utilizado como modelo experimental en mutagénesis, ya que los cambios genéticos inducidos que se detectan en Drosophila son similares a los encontrados con los sistemas de prueba de mamíferos.
4. facilidad para introducir y combinar mutaciones en su genoma.

2. ¿Cómo afecta la temperatura la duración del ciclo de vida de este insecto?

El ciclo de vida dura unos 10 días a 25º C (temperatura óptima) y 15 días a 20º C, temperaturas superiores a 30ºC producen la esterilización o muerte de las moscas, e inferiores a 10ºC produce ciclos de vida prolongados.

3. Menciona cuantas y cuáles son las etapas del ciclo de vida de este insecto

El huevo de Drosophila se forma durante un período de  aproximadamente 3 días y medio. La fecundación es interna y ocurre en el útero. El óvulo al caer al útero ocupa la mayor parte de éste, quedando los filamentos dorsales del óvulo suspendidos en los oviductos. Los espermatozoides pasan al oviducto cuando se han liberado del receptáculo seminal del macho. Existe polispermia; o sea, que entra más de un espermatozoide. Una vez fecundado, la madre lo deposita en el exterior, iniciándose la embriogénesis. Y es durante esta etapa cuando se determina la polaridad antero-posterior y más tardíamente la dorso-ventral. Después de unas 24 horas, el embrión eclosiona dando lugar a una larva de vida libre que pasará por 3 etapas larvarias (LI, LII y LIII). Durante este período las células larvarias básicamente no proliferan; sin embargo, crecen en volumen debido a la endoreduplicación de su material genético. A los 5 días la larva entra en pupación y se inicia la metamorfosis. Durante esta etapa, la mayoría de tejidos larvarios son histolizados. Las estructuras adultas se formarán principalmente a partir de la reorganización de los discos imaginales (que darán lugar a las estructuras epidérmicas de la cabeza, tórax y genitales externos del adulto) y los histoblastos (que formarán la epidermis abdominal del adulto). A las pocas horas de vida, la mosca adulta es fértil y se inicia de nuevo el ciclo vital. 

4. ¿Qué significa que Drosophila melanogaster sea un organismo holometábolo?

Es decir, presenta unas  etapas larvarias y una etapa adulta separadas por una etapa pupal, durante la cual tiene lugar una metamorfosis completa.

5. ¿Qué  son los discos imaginales y cual es su importancia?

Los discos imaginales son las estructuras larvarias que darán lugar a la epidermis del adulto de Drosophila melanogaster. Los precursores de estos discos son unos conjuntos de células (cuyo número oscila entre 10 y 40 dependiendo del disco imaginal) que se segregan como invaginaciones de la epidermis embrionaria y que crecen por mitosis justo hasta antes de la metamorfosis, incrementando su número de células por un factor de 1000 aproximadamente. Las células de los discos son histológicamente similares, pero difieren enormemente en sus patrones de expresión génica.

Existen muchas ventajas por las que se utilizan los discos imaginales como modelo de estudio. Se pueden aislar fácilmente, los estudios bioquímicos son posibles debido a que se puede acumular gran cantidad de discos en un período relativamente corto de tiempo y además se pueden mantener in vitro en cultivos celulares.

Existen muchas ventajas por las que se utilizan los discos imaginales como modelo de estudio. Se pueden aislar fácilmente, los estudios bioquímicos son posibles debido a que se puede acumular gran cantidad de discos en un período relativamente corto de tiempo y además se pueden mantener in vitro en cultivos celulares.

“Análisis de un rasgo de HAD, HAR, HLX (practica teórica) y construcción y análisis de genealogías”

1.    ¿Qué es un gen dominante?

Se refiere al miembro de un par alélico que se manifiesta siempre en un fenotipo, tanto si se encuentra en dosis doble, habiendo recibido una copia de cada padre (combinación homocigótica) como en dosis simple, en la cual uno solo de los padres aportó el alelo dominante en su gameto (heterocigosis).

Se representa con una letra mayúscula. Ej.: A, L.

1.    ¿Qué es un gen recesivo?

Aquel miembro de un par alélico que transmite un carácter que solamente se manifiesta si no está presente el alelo dominante. Se le representa con una letra minúscula, correspondiente a la del dominante. Ej.: a, l.

2.    Escribe las tres leyes de Mendel y da una breve explicación de cada una.

Primera ley de Mendel; ley de la uniformidad

Cuando se cruzan dos variedades individuos de raza pura, ambos homocigotos,  para un determinado carácter, todos los híbridos de la primera generación son iguales.

        Los individuos de esta primera generación filial (F1) son heterocigóticos o híbridos, pues sus genes alelos llevan información de las dos razas puras u  homocigóticas: la dominante, que se manifiesta, y la recesiva, que no lo hace..

        Mendel llegó a esta conclusión trabajando con una variedad pura de plantas de guisantes que producían las semillas amarillas y con una variedad que producía las semillas verdes. Al hacer un cruzamiento entre estas plantas, obtenía siempre plantas con semillas amarillas.

Segunda Ley de Mendel: Ley de la segregación independiente de los caracteres.

Los factores que se transmiten de generación en generación se separan (segregan) en los parentales y se unen al azar en los descendientes para definir las características de los nuevos individuos.

Mendel tomó plantas procedentes de las semillas de la primera generación (F1) del experimento anterior y las polinizó entre sí. Aunque el alelo que determina la coloración verde de las semillas parecía haber desaparecido en la primera generación filial, vuelve a manifestarse en esta segunda generación.

Los dos alelos distintos para el color de la semilla presentes en los individuos de la primera generación filial, no se han mezclado ni han desaparecido, simplemente ocurría que se manifestaba sólo uno de los dos. Cuando el individuo de fenotipo amarillo y genotipo Aa, forme los gametos, se separan los alelos, de tal forma que en cada gameto sólo habrá uno de los alelos y así puede explicarse los resultados obtenidos.

Tercera Ley de Mendel: Ley de la distribución independiente o de la libre combinación de los caracteres hereditarios.

Si se consideran dos caracteres simultáneamente, las segregaciones de los factores genéticos no interfieren entre sí; es decir, los factores que determinan un carácter se heredan independientemente de los que determinan el otro.

Mendel cruzó plantas de guisantes de semilla amarilla y lisa con plantas de semilla verde y rugosa ( Homocigóticas ambas para los dos caracteres).

Las semillas obtenidas en este cruzamiento eran todas amarillas y lisas, cumpliéndose así la primera ley para cada uno de los caracteres considerados, y revelándonos también que los alelos dominantes para esos caracteres son los que determinan el color amarillo y la forma lisa.

Las plantas obtenidas y que constituyen la F1 son dihíbridas (AaBb).  Estas plantas de la F1 se cruzan entre sí, teniendo en cuenta los gametos que formarán cada una de las plantas.  Se puede apreciar que los alelos de los distintos genes se transmiten con independencia unos de otros, ya que en la segunda generación filial F2 aparecen guisantes amarillos y rugosos y otros que son verdes y lisos, combinaciones que no se habían dado ni en la generación parental (P), ni en la filial primera (F1).

3.    ¿Qué es la penetrancia y la expresividad variable?

Penetrancia: La frecuencia de la expresión de un alelo cuando está presente en el genotipo del organismo (Si 9/10 de los individuos que llevan el alelo expresan la característica, se dice que ésta tiene el 90% de penetrancia).

Expresividad: Variación en la expresión de un alelo cuando éste es penetrante.

Rango de posibles fenotipos expresados por un genotipo, dependiendo de circunstancias ambientales o de interacción con otros genotipos no alélicos.

4.    ¿Qué es el caso índice?

Individuo que es el primero en mostrar una enfermedad genética en una familia. Se denomina también probando.

En epidemiología, se llama caso índice al primer caso que da lugar a la atención del investigador y origina una serie de acciones, visitas y pasos necesarios para conocer un foco de infección. Puede ocurrir que el caso sea primario, coprimario o secundario dentro del foco.

5.    ¿Qué es una fatría?

Grupo de individuos de una misma generación que pertenecen a la misma familia. La palabra gens en latín <significa linaje o descendencia común del padre o tótem de la tribu>. En él se elige a un jefe, que se puede derrocar si no cumple con sus deberes, dentro de él no podría haber matrimonios, había una ayuda mutua entre sus miembros. La unión de varias gens se denomina fatría.

Referencias Bibliográficas

o    Griffiths, A.J.F., S.R. Wessler, R.C. Lewontin & S.B. Carrol (2008). Introducción al análisis genético. 9th edición. McGraw-Hill Interamericana

o    Alberts, Bray, Hopkin, Johnson, Lewis, Raff, Roberts, Walter. Introducción a la Biología Celular. Editorial Médica Panamericana.

o    http://www.mendelweb.org/Mendel.html

o    http://bioinformatica.uab.es/genetica/curso/Historia.html