Plásmidos

AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN DE PLÁSMIDOS OBTENIDOS DE UNA CEPA DE E. coli MEDIANTE UNA LISIS ALCALINA, SU DIGESTIÓN CON ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN Y ANÁLISIS E IDENTIFICACIÓN A TRAVÉS DE ELECTROFORESIS 

Los plásmidos son moléculas de DNA extracromosómico, circular y generalmente de pequeño tamaño que se encuentran en muchas especies bacterianas y que se pueden replicar de manera independiente del DNA cromosómico. Los plásmidos no son necesarios para la viabilidad general de la célula, pero pueden contener genes que contribuyen a la supervivencia en condiciones especiales, como los que confieren resistencia a antibióticos, a metales etc. Algunas clases de plásmidos poseen además la propiedad conocida como "replicación relajada", esto es, están presentes en forma de muchas copias por célula, lo que facilita enormemente su aislamiento y purificación. (Galván, 2008)

Los plásmidos poseen un interés singular en Ingeniería Genética por ser uno de los sistemas vectores más sencillos de usar. Un vector de clonación es un sistema que permite introducir en una célula hospedadora un fragmento de DNA que se pretende clonar; en esta célula hospedadora el vector se replica y expresa, en su caso la molécula que resulta de la unión de un DNA vector con el DNA de interés (denominado entonces "inserto") se denomina molécula de vector recombinante. (Galván, 2008)

Para ser utilizado como vector de clonación, un plásmido ideal debe poseer al menos tres características:

1) Debe tener su propio origen de replicación y por tanto la capacidad de replicación autónoma independiente del genoma del hospedador.

2) Debe tener sitios de clonación múltiple que permitan la apertura del DNA con enzimas de restricción y hace posible la clonación de insertos de DNA en la forma y orientación determinada.

3) Debe poseer marcadores genéticos seleccionables que permiten aislar las células hospedadoras que contengan el vector.

La mayoría de los plásmidos naturales no cumplen todas estas condiciones, por lo que una primera tarea de la Ingeniería Genética ha consistido en la construcción de plásmidos artificiales, combinando en una misma molécula diversos rasgos útiles procedentes de los plásmidos naturales. (Galván, 2008)

El método empleado para la obtención del plásmido se denomina de "lisis alcalina": se basa en la desnaturalización y precipitación selectiva del DNA cromosómico en medios con NaOH y SDS. En estas condiciones el DNA plasmídico permanece intacto debido principalmente a su pequeño tamaño y su naturaleza circular y superenrollada.

Endonucleasas de restricción también llamadas enzimas de restricción, son proteínas bacterianas que cortan en secuencias cortas y específicas al DNA. Son las principales herramientas de la tecnología del DNA recombinante.

Las enzimas de restricción se denominan según el organismo en el que se descubrieron, utilizando un sistema alfanumérico. La enzima EcoRI proviene de Escherichia coli; HindIII se descubrió en Hemophilus influenzae. Se nombran a partir de las bacterias de las que son extraídas, su nombre está dado según el género y la especie de la bacteria de donde se aisló por primera vez esta enzima. La primera letra representa el género de la bacteria, las próximas dos indican la especie, una cuarta letra indica la cepa, y un número al final indica la cantidad de enzimas que se han aislado de esa cepa.(Cultek, 2006)

Hay dos tipos de enzimas de restricción:

• Las enzimas de Tipo I cortan las dos cadenas del DNA en una posición aleatoria a cierta distancia del sitio de restricción.

• Las enzimas de Tipo II reconocen una secuencia específica y cortan las dos cadenas de la molécula de DNA con absoluta precisión dentro de la secuencia reconocida. Las secuencias reconocidas son palindrómicas, es decir, la secuencia de una de las cadenas leída en dirección 5' -> 3' es la misma que la secuencia de la cadena complementaria leída también en dirección 5' -> 3'. (Cultek, 2006)

La enzima de restricción EcoRI reconoce y se une a la secuencia palindrómica GAATTC. El corte del DNA en este sitio produce colas de cadena sencilla complementarias. La colas de cadena sencilla resultantes pueden unirse con colas complementarias de otros fragmentos de DNA para formar moléculas de DNA recombinante. (Cultek, 2006)

HindIII es una enzima de restricción de tipo II posee una diana de restricción en el DNA; AAGCTT, de cadena doble dependiente de una secuencia metilada, palindrómica y asimétrica, sobre la cual su actividad catalítica hidrolasa genera extremos cohesivos. (Cultek, 2006)

El objetivo de la práctica primero fue llevar a cabo el aislamiento y la purificación del DNA de plásmido contenido en una cepa de E.coli mediante la técnica de miniprep por lisis alcalina, después realizar la digestión simple y doble del plásmido pDEST22 con las enzimas de restricción EcoRI y HindIII, con y sin RNAsa para apreciar el efecto del RNA como contaminante y finalmente por electroforesis en agarosa analizar los topoisómeros generados a partir de la digestión correspondiente.

OBSERVACIONES Y RESULTADOS

En primer lugar se llevó a cabo el aislamiento y la purificación de los plásmidos contenidos en una cepa de E.coli mediante la técnica de Miniprep por lisis alcalina. Después se cuantificó y evaluó su pureza mediante espectrofotometría.

REFERENCIAS

Cultek S. L.U. (2006). Tecnología del DNA recombinante. Recuperado de  http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/DNA-recombinante/Tecnica%20DNA%20recombinante.pdf

Galván, A. (2008). Aislamiento y purificación del DNA de un plásmido recombinante. Recuperado de http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/39%20AISLAMIENTO%20Y%20PURIFICACI%C3%93N%20DEL%20DNA%20DE%20UN%20PL%C3%81SMIDO%20RECOMBINANTE.pdf