INTRODUCCIÓN
El DNA, está constituido por dos cadenas de nucleótidos, formando una doble hélice, a manera de escalera enrollada, su estabilidad se debe a la formación de puentes de hidrógeno, además existe la presencia de enlaces entre bases nitrogenadas (A-T; G-C) y enlaces disulfuro. El modo de réplica es semiconservativo.
Obtener DNA relativamente puro y amplificable resulta fundamental para los posteriores usos a los que está destinado: tiene gran importancia en los procesos para el diagnóstico de enfermedades, trastornos genéticos y en el marco de investigación de tipo forense. La tarea demanda una “puesta a punto” de las técnicas de extracción utilizadas, con el objeto de determinar las condiciones ideales en las que se obtenga el máximo rendimiento, por lo que en el procedimiento se debe de tener ciertos cuidados entre los que están la inactivación de nucleasas celulares, trabajar con soluciones y materiales estériles y, con protección personal (guantes, cubrebocas, cofias) para evitar contaminar las muestras.
En general los métodos de extracción y purificación de DNA tienen una serie de etapas básicas :
*Obtención de la muestra: Constituye la etapa previa de todo análisi genético.
*Lisis celular: Ruptura de la bicapa lipídica de las membranas celulares (dentro de la cual se destruye membranas nucleares), el tratamiento se realiza con detergentes, agentes quelantes que secuestran cationes estabilizadores de la membrana, choque osmótico,etc.
*Clarificación: Eliminación de proteínas (son los principales contaminantes del extracto).
* Concentración del DNA: Precipitación con alcoholes y purificación (lavado para eliminar restos de reactivos y solventes que pueden inhibir la Taq polimerasa), y resuspensión.
*Análisis: Cualitativo por electroforesis y cuantitativo por espectrofotometría.
Para muestra de sangre periférica de DNA (CTAB), se han descrito y publicado distintos protocolos. Los métodos de extracción de DNA que realizamos se basan en los principios de las dos alternativas metodológicas básicas las cuales difieren en la etapa de la purificación de las proteínas del extracto; el método que aprovecha las propiedades desnaturalizantes que tiene ciertos solventes orgánicos y el fundamentado en el cambio de solubilidad que experimentan las proteínas cuando son sometidas a modificaciones en la concentración salina del medio. Estos métodos presentan algunas ventajas y desventajas respecto a otros: son económicos, se manejan compuestos químicos tóxicos o contaminantes al ambiente en el caso del método de Fenol - cloroformo y se obtienen considerables cantidades y buena pureza del DNA.
Una vez que se ha realizado la extracción del ADN es necesario revisar la integridad y la cantidad del mismo. La cuantificación del ADN se llevará a cabo por estimación de la intensidad de una banda en la separación por electroforesis en geles de agarosa, en el que el ADN será teñido por el colorante Gel Red y mediante técnicas de espectrofotometría de luz ultravioleta.
MATERIAL Y MÉTODOS
La metodología se tomó del manual de Genética Molecular.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Inicialmente es necesario llevar a cabo una lisis para liberar al DNA del interior celular, para lo cual se utilizan los buffers de extracción que contienen 1) detergentes, como sodio dodecilo sulfato (SDS) a una concentración final del 1% o Triton X al 0.5%; 2) una molécula quelante (p. ej. EDTA, 50mM), que tiene cuatro grupos carboxilo y dos grupos amino, cuya forma completamente de-protonizada puede unirse a cualquier complejo metálico en solución, quitando a los cationes de la solución para desestabilizar la membrana celular e inhibir a las DNAsas; 3) sales (p.ej. NaCl 20mM), que forman una capa iónica suave que recubre al ADN protegiéndolo y ayudando a evitar su degradación; 4) Tris-HCl 20mM con pH entre 7.5 y 8.2 para mantener el pH de la solución estable; 5) proteinasa K para degradar proteínas o enzimas (Sambrook, J. 1989).
La absorción de luz UV es una de las características físicas del DNA que permite su identificacion, cuantificacion y la evaluación de su pureza por medio de la espectrofotometría.
Los valores encontrados con respecto a la calidad del DNA obtenido, medidos mediante espectrofotometría son presentados en la TABLA I, donde se presentan la relación de los valores de absorbancia (A260/ A280) y la concentración en ng/uL.
TABLA I. Resultados de las determinaciones espectrofotométricas.
El cálculo de la concentración de DNA (ng/uL), se realizó mediante la fórmula A260 x 50 x dilución de la muestra (el número 50 representa una constante relacionada con una solución de DNA doble hélice, cuya concentración es de 50 ng/uL con A260 =1)
Los nucleótidos tienen un máximo de absorbancia a 260 nm (con una DO=1). Los valores de la relación A260/A280= 1.7 - 1.9 es indicativo de que la muestra de DNA es pura. En nuestro caso los valores oscilan entre 1,8 y 1,9 indicando una buena desproteinización de las muestras de DNA en ambas muestras y una posible contaminación por fenol en el caso del método de fenol - cloroformo.
En relación a la concentración de DNA expresada en ng/uL se observa que se obtuvo cantidades altas de DNA por el método de Perclorato de sodio en comparación con el de Fenol-cloroformo.
La integridad obtenida del ADN de sangre periférica se muestra en la FIG. 1, en los carriles 9 y 10
respectivamente, en ambas se pueden observar bandas bien definidas y sin degradación.
Sin embargo se observa un poco de contaminación en el método de fenol..
El tamaño del poro del gel es predeterminado ajustando su concentración en el gel; entonces a mayor
concentración menor tamaño del poro. En la experimentación se utilizó 0.8% de agarosa, una
concentración baja considerando el rango de trabajo 0.7-2%, con este gel de agarosa se obtiene
una buena separación (resolución) de grandes fragmentos de ADN (0.5-10 Kb). Dependiendo
igualmente de la concentración, nuestro gel de bajo porcentaje, es muy frágil.
BIBLIOGRAFÍA
Riera, M. A., Rojas, M.E. y Zapata, P. D. Protocolo de extracción de DNA por salting-out para pequeños volúmenes de sangre. Laboratorio de Biotecnología Molecular. Módulo de Bioquímica y Farmacia. FCEQyN – UNaM: Misiones – Argentina.
Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. (1989). «Gel electroforesis of DNA» en: Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. (Eds.) Molecular Cloning: a Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, capítulo 6.
TPS: Cuantificación de ADN y electroforesis en gel de agarosa. Introducción a la Biología Celular y Molecular. Universidad Nacional de Quilmes. Recuperado el 21 de marzo de 2015, de https://ibcmunq.files.wordpress.com/2010/03/tp5.pdf
Westermeier, R. (1997). Electroforesis in Practice: a Guide to Methods and Applications of DNA and Protein Separation, VCH, Weinheim.
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