RESUMEN
Los plásmidos son moléculas de DNA extracromosómico, circular y generalmente de pequeño tamaño que se encuentran en muchas especies bacterianas y que se pueden replicar de manera independiente del DNA cromosómico. El objetivo de esta práctica primeramente fue llevar a cabo el aislamiento y la purificación del DNA de plásmido resistente a la ampicilina contenido en una cepa de E. coli mediante la técnica de miniprep por lisis alcalina, cuantificando y evaluando su pureza mediante espectrofotometría, donde nos fue posible apreciar cómo influye la inactivación con RNAsas con respecto a la que no se inactiva. Después realizamos la digestión simple y doble del plásmido pDEST22 con las enzimas de restricción EcoRI y HindIII, con y sin RNAsa para apreciar el efecto del RNA como contaminante y por último con el fin de saber si la restricción transcurrió eficientemente se corrió una electroforesis en gel de agarosa, en la cual analizamos los topoisómeros obtenidos y pudimos comprobar los fragmentos..
INTRODUCCIÓN
Los plásmidos son moléculas de DNA extracromosómico, circular y generalmente de pequeño tamaño que se encuentran en muchas especies bacterianas y que se pueden replicar de manera independiente del DNA cromosómico. Los plásmidos no son necesarios para la viabilidad general de la célula, pero pueden contener genes que contribuyen a la supervivencia en condiciones especiales, como los que confieren resistencia a antibióticos, a metales etc. Algunas clases de plásmidos poseen además la propiedad conocida como "replicación relajada", esto es, están presentes en forma de muchas copias por célula, lo que facilita enormemente su aislamiento y purificación. (Galván, 2008)
Los plásmidos poseen un interés singular en Ingeniería Genética por ser uno de los sistemas vectores más sencillos de usar. Un vector de clonación es un sistema que permite introducir en una célula hospedadora un fragmento de DNA que se pretende clonar; en esta célula hospedadora el vector se replica y expresa, en su caso la molécula que resulta de la unión de un DNA vector con el DNA de interés (denominado entonces "inserto") se denomina molécula de vector recombinante. (Galván, 2008)
Para ser utilizado como vector de clonación, un plásmido ideal debe poseer al menos tres características:
1) Debe tener su propio origen de replicación y por tanto la capacidad de replicación autónoma independiente del genoma del hospedador.
2) Debe tener sitios de clonación múltiple que permitan la apertura del DNA con enzimas de restricción y hace posible la clonación de insertos de DNA en la forma y orientación determinada.
3) Debe poseer marcadores genéticos seleccionables que permiten aislar las células hospedadoras que contengan el vector.
La mayoría de los plásmidos naturales no cumplen todas estas condiciones, por lo que una primera tarea de la Ingeniería Genética ha consistido en la construcción de plásmidos artificiales, combinando en una misma molécula diversos rasgos útiles procedentes de los plásmidos naturales. (Galván, 2008)
El método empleado para la obtención del plásmido se denomina de "lisis alcalina": se basa en la desnaturalización y precipitación selectiva del DNA cromosómico en medios con NaOH y SDS. En estas condiciones el DNA plasmídico permanece intacto debido principalmente a su pequeño tamaño y su naturaleza circular y superenrollada.
Endonucleasas de restricción también llamadas enzimas de restricción, son proteínas bacterianas que cortan en secuencias cortas y específicas al DNA. Son las principales herramientas de la tecnología del DNA recombinante. (“Fragmentos de restricción…..”)
Las enzimas de restricción se denominan según el organismo en el que se descubrieron, utilizando un sistema alfanumérico. La enzima EcoRI proviene de Escherichia coli; HindIII se descubrió en Hemophilus influenzae. Se nombran a partir de las bacterias de las que son extraídas, su nombre está dado según el género y la especie de la bacteria de donde se aisló por primera vez esta enzima. La primera letra representa el género de la bacteria, las próximas dos indican la especie, una cuarta letra indica la cepa, y un número al final indica la cantidad de enzimas que se han aislado de esa cepa.(Cultek, 2006)
Hay dos tipos de enzimas de restricción:
• Las enzimas de Tipo I cortan las dos cadenas del DNA en una posición aleatoria a cierta distancia del sitio de restricción.
• Las enzimas de Tipo II reconocen una secuencia específica y cortan las dos cadenas de la molécula de DNA con absoluta precisión dentro de la secuencia reconocida. Las secuencias reconocidas son palindrómicas, es decir, la secuencia de una de las cadenas leída en dirección 5' -> 3' es la misma que la secuencia de la cadena complementaria leída también en dirección 5' -> 3'. (Cultek, 2006)
La enzima de restricción EcoRI reconoce y se une a la secuencia palindrómica GAATTC. El corte del DNA en este sitio produce colas de cadena sencilla complementarias. La colas de cadena sencilla resultantes pueden unirse con colas complementarias de otros fragmentos de DNA para formar moléculas de DNA recombinante. (Cultek, 2006)
HindIII es una enzima de restricción de tipo II posee una diana de restricción en el DNA; AAGCTT, de cadena doble dependiente de una secuencia metilada, palindrómica y asimétrica, sobre la cual su actividad catalítica hidrolasa genera extremos cohesivos. (Cultek, 2006)
El objetivo de esta práctica primeramente fue llevar a cabo el aislamiento y la purificación del DNA de plásmido contenido en una cepa de E.coli mediante la técnica de miniprep por lisis alcalina, después realizar la digestión simple y doble del plásmido pDEST22 con las enzimas de restricción EcoRI y HindIII, con y sin RNAsa para apreciar el efecto del RNA como contaminante y finalmente por electroforesis en agarosa analizar los topoisómeros generados a partir de la digestión correspondiente.
OBSERVACIONES Y RESULTADOS
En primer lugar se llevó a cabo el aislamiento y la purificación de los plásmidos contenidos en una cepa de E.coli mediante la técnica de Miniprep por lisis alcalina. Después se cuantificó y evaluò su pureza mediante espectrofotometría
Tabla no. 1 Resultados de las determinaciones espectrofotométricas de la cuantificación y la pureza de los plásmidos obtenidos para cada uno de los equipos.
Nosotros tomamos de nuestra muestra una pequeña cantidad a la cual no se inactivó con RNAsas, para poder apreciar la diferencia que se presenta con respecto a las demás muestra inactivadas con RNAsas. De acuerdo a los resultados obtenidos como se observa en la tabla no.1 la pureza de acuerdo a la relación 260/280 es mayor a 1.8 sin RNAsa y se encuentra más elevado que todos los valores obtenidos, lo cual indica que la muestra no se encuentra pura y efectivamente se encuentra contaminada con RNA.
Fig. 1 Electroforesis de DNA plasmìdico (pDEST22) extraído de una cepa de E. coli por el método de miniprep por lisis alcalina. En gel agarosa al 0.7%, 2X en TAE 1X y colorante Gel Red. Carril M: marcador de peso molecular; Invitrogen 100 pb DNA Ladder. Carril A: Plásmido sin RNAsa. Carriles B, D, F y H: Plásmidos sin digerir (SD). Carril C: digestión con EcoRI. Carril E: digestión con HindIII. Carriles G e I: digestión doble (EcoRI y Hindlll).
Las muestras para correr la electroforesis se agregaron de la siguiente manera:
Equipo 6. Carril B (SD) y C (EcoRI).
Equipo 1. Carril D (SD) y E (Hindlll).
Equipo 2. Carril F (SD) y G (EcoRI + Hindlll).
Equipo 3. Carril H (SD) e I (EcoRI + Hindlll).
Fig. 2 Electroforesis de DNA plasmìdico (pDEST22) extraído de una cepa de E. coli por el método de miniprep por lisis alcalina. En Gel agarosa al 0.7%, 2X, en TAE 1X y colorante Gel Red. Carril M: marcador de peso molecular; Invitrogen 100 pb DNA Ladder.Carril A: Plásmido sin RNAsa. Carriles B, D, F y H: plásmidos sin digerir (SD). Carril C: digestión con EcoRI. Carril E: digestión con Hindlll. Carriles G e I: digestión doble (EcoRI y Hindlll). Muestra del equipo: carriles F y G.
Las muestras para correr la electroforesis se agregaron de la siguiente manera:
Equipo 8. Carril B (SD) y C (EcoRI).
Equipo 4. Carril D (SD) y E (Hindlll).
Equipo 5. Carril F (SD) y G (EcoRI + Hindlll).
Equipo 7. Carril H (SD) e I (EcoRI + Hindlll).
En ambas corridas electroforéticas el corte de cada enzima de restricción se puede visualizar en los carriles C y E ; donde se encuentra solo una de ellas. También se puede observar claramente que la restricción no fue completa cuando la enzima de restricción se encuentra sola ya que no fue suficiente para cortar todo el DNA plasmídico, sobre todo en HindIII es más notorio.
La intensidad de la banda es más fuerte en los Carriles A lo cual es indicativo de que la cantidad de isómero fue más abundante. Y en los Carriles C se pueden apreciar claramente los cortes del sitio de restricción de EcoRI y en el caso de Hindlll (carril E) se observan sus dos sitios de restricción.
En ambas figuras los carriles G e I ya se pueden visualizar los 3 sitios de restricción obtenidos por la digestión doble, correspondiente a los 3 topoisómeros el circular, el menos enrollado y el superenrollado. Sin embargo en la fig. 2 hubo una digestión completa en comparación con la fig.1 en la cual se puede apreciar que el DNA plasmídico no se alcanzó a cortar todo.
En las dos corridas electroforéticas se observa que la cantidad de muestra fue mucha, lo cual se puede apreciar por el barrido, además puede ser indicativo de que no se encontraba tan puro.
CONCLUSIÓN
Al finalizar dicha experimentación, que se llevó a cabo en 2 sesiones, como primer paso se pudò llevar a cabo el aislamiento y la purificación del DNA plasmídico resistente a la ampicilina contenido en una cepa de E.coli mediante la técnica de miniprep por lisis alcalina, después realizamos la digestión simple y doble del plásmido pDEST22 con las enzimas de restricción EcoRI y HindIII, con y sin RNAsa respectivamente para apreciar el efecto del RNA como contaminante y por último con el fin de saber si la restricción transcurrió eficientemente se corrió una electroforesis en gel de agarosa, en la cual pudimos analizar los topoisómeros obtenidos a partir de las muestras sometidos o no a la digestión, ya sea sencilla o doble, los cuales son de aproximadamente pb
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