La técnica de ELISA (en inglés enzyme-linked immunosorbent assay) fue diseñada por científicos suecos y holandeses en 1971. Es un ensayo inmunoenzimático empleado en el área médica para la cuantificación de hormonas, autoanticuerpos, inmunoglobulinas contra antígenos de patógenos, toxinas y antígenos.
Se basa en la detección antígeno(Ag) o anticuerpo (Ac), inmovilizado sobre una fase sólida y mediante anticuerpos que directa o indirectamente producen una reacción, la prueba recurre al empleo de inmunógenos, haptenos ó anticuerpos marcados con una enzima cuyo producto colorido, puede ser medido espectrofotométricamente.Este principio tiene las propiedades de un inmunoensayo ideal: es versátil, robusto, simple en su realización, emplea reactivos económicos y consigue,mediante el uso de la fase sólida, de una separación fácil entre la fracción retenida y la fracción libre. (Cruz, M. 2011)
Estos ensayos se apoyan en tres características biológicas fundamentales:la extraordinaria especificidad de los anticuerpos, el elevado poder catalítico y la alta especificidad de las enzimas. Mediante la combinación de la reacción inmunológica con un indicador altamente sensible, el débil efecto inmunológico se ve reforzado por la amplificación enzimática, de forma que se consigue una elevada sensibilidad y detectabilidad; si a esto le añadimos la especificidad de la reacción inmunológica, se podrá comprender su aplicabilidad en el diagnóstico clínico. Gracias a ello se han podido estudiar: hormonas, fármacos, péptidos y proteínas, vitaminas, agentes patógenos, otros analitos y, por supuesto, anticuerpos dirigidos contra los propios constituyentes del organismo (autoanticuerpos), contra diversos microorganismos o contra inmunógenos vacunales. (Cruz, M. 2011)
La reacción antígeno-anticuerpo se detecta generalmente mediante un cambio de color o la emisión de luz, producidos por la interacción de la enzima y su substrato. Ambos efectos son cuantificables y proporcionales a la intensidad de la interacción. El uso de substratos de depósito permite la visualización de los resultados y es muy utilizado sobre membranas. (Cruz, M. 2011)
FUNDAMENTO
Cuando están presentes, los anticuerpos séricos se unen a una combinación de los antígenos del dengue ligados a la superficie de poliestireno de las tiras de prueba de los micropocillos. El suero restante se elimina mediante lavado y se agregan anticuerpos anti-IgG humana conjugados con peroxidasa. Los micropocillos se lavan y se agrega un sistema de sustrato incoloro de tetrametilbencidina y peróxido de hidrógeno (cromógeno de TMB). La enzima hidroliza el sustrato y el cromógeno se vuelve de color azul. Después de detener la reacción con ácido, la TMB se vuelve de color amarillo. Los cambios de color indican la presencia de anticuerpos IgG contra el dengue en la muestra de la prueba.
Dentro de los parámetros fisicoquímicos que intervienen en la unión del antígeno con el anticuerpo tenemos:
Ø Fuerzas de Van der Walls producidas por el movimiento de átomos en la superficie de las moléculas generado por un cambio eléctrico. Son fuerzas débiles presentes cuando la proximidad del Ag y el Ac es grande.
Ø Fuerzas electrostáticas originadas por la fuerza de atracción entre moléculas de carga iónica opuesta, como sucede con los grupos NH3+ que reaccionan ávidamente con el grupo COOH-.
Ø Uniones por puentes de hidrógeno son de carga energética baja entre átomos electropositivos de hidrógeno y átomos electronegativos de oxígeno o nitrógeno.
Los métodos de ELISA dependiendo de la actividad enzimática se dividen en dos tipos: competitivos y no competitivos.
ELISA COMPETITIVO: En este método, el anticuerpo de la muestra va a competir con el conjugado por un número limitado de sitios de unión del antígeno. Habrá ausencia de color en una muestra positiva debido a que el sustrato no encontrará a la enzima porque el conjugado ha sido desplazado por el anticuerpo presente en la muestra.
ELISA NO COMPETITIVO: Consiste en enfrentar la muestra con el antígeno o anticuerpo que está en la fase sólida. Si una muestra es positiva se formará el complejo antígeno-anticuerpo y al agregar el conjugado reaccionará con el respectivo sustrato desarrollando color.
Dentro de los no competitivos tenemos, los directos que detectan antígenos y los indirectos que detectan anticuerpos.
ELISA INDIRECTO CONSTA DE LAS SIGUIENTES ETAPA
Fijación del Antígeno a la fase sólida:
La reacción inmunológica tiene lugar en la fase sólida, ésta puede ser de plástico, vidrio o nitrocelulosa. Actualmente los más usados son los de plástico, dentro de éstos los de poliestireno gammairradiados y los de cloruro de polivinilo porque tienen mayor capacidad para formar enlaces estables que los de poliestireno no tratados.
El antígeno diluido en buffer es adherido a la fase sólida por enlaces electrostáticos entre los sitios activos del plástico y regiones de la proteína responsables de esta interacción. El buffer puede ser carbonato a pH 9.6 o buffer fosfato salino (PBS 1X) a pH 7.4.
La estabilidad de los enlaces electrostáticos, el tiempo de incubación y la temperatura son factores importantes a tener en cuenta para evitar pérdidas de las proteínas y que pueden afectar la sensibilidad del ensayo.
2. Reacción con anticuerpo:
La reacción del antígeno con el anticuerpo se debe realizar en condiciones similares a las fisiológicas pH 7.4, temperatura de 37ºC y concentración salina equivalente a 0.15M de NaCl. Estas condiciones pueden variar dentro de un rango razonable sin afectar la reacción.
Moléculas no específicas en solución pueden adherirse a la fase sólida afectando el resultado final del ensayo, para disminuir este riesgo se suele agregar al medio de reacción un exceso (0.1% a 1%) de una proteína inerte para que compita eficientemente por los sitios de unión inespecíficos en la fase sólida. Esta proteína puede ser seroalbúmina bovina, caseína, suero entero, gelatina u otros.
También es necesario añadir al medio tween 20 para evitar uniones inespecíficas de macromolécula. Por este motivo es agregado en los tampones de dilución y de lavado.
3. Adición del conjugado enzimático:
El conjugado enzimático se prepara por unión covalente de una enzima con el anticuerpo; esta enzima puede ser peroxidasa de rábano (Horseradish peroxidase, HRP), fosfatasa alcalina (AP) o beta-galactosidasa.
Los criterios a tomar en cuenta en la selección de la enzima apropiada son su toxicidad, estabilidad, disponibilidad, viabilidad de conjugarla eficazmente con el anticuerpo elegido, sensibilidad y precio.
4. Adición del sustrato:
La elección del sustrato va de acuerdo con el tipo de enzima presente en el conjugado. El sistema AP hidroliza al p-nitrofenil fosfato o p-nitrofenol generando un producto soluble de color amarillo.
El sistema HRP reduce al sustrato peróxido de hidrógeno produciendo oxígeno que oxida a otros compuestos cromógenos tales como:
o Tetrametilbenzidina (TMB), cuya oxidación genera un producto de color azul oscuro.
o o-phenylene diamine (OPD), que es oxidado a un producto coloreado que varía del naranja al pardo oscuro.
o Ácido azino-(3-etil)-benzo-sulfónico (ABTS), cuya oxidación genera un producto que va del verde al azul.
La intensidad del color desarrollado es de acuerdo con la cantidad de enzima presente en la reacción.
Por último la lectura se realiza en un espectrofotómetro a 450 nanómetros
ANÁLISIS DE RESULTADOS
El Dengue virus (DENV) es un virus de RNA de cadena simple de un diámetro de 50 nm perteneciente a la familia de los Flaviviridae. Se distinguen 4 tipos serológicos (DEN-1, DEN-2, DEN-3 y DEN-4). El virus se extiende por todo el mundo y aparece de forma endémica en sur y centroamérica, en el oeste de áfrica, en el sureste de asia y en la región oeste del océano pacífico. El grupo de arbovirus del dengue se transmite por medio de mosquitos, principalmente los de las especies Aedes aegypti y Aedes albopictus. La infección por dengue, asociada a una enfermedad febril, se caracteriza por la aparición súbita de fiebre, cefalea intensa, mialgia, artralgia y exantema. Algunas complicaciones graves de la infección son la fiebre hemorrágica del dengue y el síndrome de choque por dengue. (Singh MP., 2010)
Las pruebas serológicas para los anticuerpos específicos al dengue, tipos IgG e IgM, pueden ser útiles para confirmar el diagnóstico primario o secundario.
Durante la primera y segunda infección se producen anticuerpos IgM contra el virus del dengue. En pacientes con una primera infección por el virus del dengue, los anticuerpos IgM se desarrollan con rapidez y se pueden detectar en los días 3 a 5 de la enfermedad en la mitad de los pacientes hospitalizados. Los niveles de IgM contra el virus del dengue alcanzan su máximo aproximadamente a las 2 semanas de la infección y descienden hasta niveles indetectables entre los 2 y 3 meses. (Dussart P., 2006)
En los pacientes con una segunda infección por el virus del dengue, la cinética de la producción de IgM es similar a la que se observa en pacientes con una infección primaria, los niveles de IgM son significativamente menores. Los anticuerpos IgM contra virus del dengue también alcanzan su máximo aproximadamente 2 semanas después de la infección, comienzan a disminuir a partir de entonces y aún se pueden detectar en aproximadamente el 30% de los pacientes 2 meses después de comenzados los síntomas. A diferencia de la primera, la segunda infección por el virus del dengue muestra una aparición casi inmediata de altos niveles de anticuerpos IgG capaces de mostrar reactividad cruzada antes de las respuestas de la IgM o simultáneamente con estas. (Dussart P., 2006)
El ensayo ELISA indirecto de anticuerpos IgG contra el virus dengue se utiliza para la detección cualitativa de anticuerpos IgG contra los serotipos DENV (1, 2, 3 y 4) en suero. Esto es debido a que en una infección primaria con el virus del Dengue, los anticuerpos IgG son producidos en bajos niveles de concentración comparados con los IgM, sin embargo persisten por muchos años después de la infección(Singh MP., 2010).
Este ensayo es una herramienta valiosa que ayuda a el diagnóstico en laboratorios clínicos para pacientes con síntomas clínicos y exposición previa en el pasado indicativos de fiebre del dengue.
Asi conocimos que La determinación de anticuerpos IgM e IgG son de utilidad para determinar si se trata de una infeción primaria o secundaria de Dengue- virus; además, los estudios de IgG pueden determinar si a pesar de tratarse de una infección secundaria, también hay una infección reciente.
En este caso nosotros realizamos el ensayo de ELISA indirecta con el “kit Panbio Dengue IgG Indirect ELISA” a partir de una muestra de suero obtenida de una compañera que refirió haber estado en previa exposición al virus Dengue y una muestra de suero positivo al DENV proporcionada por la profesora.
Como ya se mencionó anteriormente el ensayo de ELISA nos permite la detección de los anticuerpos IgG presentes en la muestras, mediante la unión de estos anticuerpos séricos a una combinación de los antígenos del dengue ligados a la superficie de poliestireno de las tiras de prueba de los micropocillos. En el ensayo que realizamos este antígeno viral fue una proteína no estructural del virus del dengue la “NS1”, la cual no forma parte de la estructura del virión, pero es expresada y secretada en la superficie de las células infectadas.(Medicina molecular;2007) Esta proteína viral es una glucoproteína de 48 kDa, sintetizada en el retículo endoplásmico rugoso (RER) de las células infectadas en forma de monómero y que posteriormente se dimeriza para asociarse a balsas lipídicas (rafts) de la membrana plasmática o estar soluble en el citoplasma y en el espacio extracelular, lo que induce la estimulación del sistema inmunitario. Sus funciones no están bien determinadas, aunque se cree que está implicada en la replicación temprana, la morfogénesis viral y en la respuesta inmunitaria específica de serotipo. Además, se ha podido establecer una relación de los niveles altos de proteína NS1 en el suero de pacientes en fase aguda con la evolución de las formas graves de la enfermedad. (Dussart P., 2006)
Los kits comerciales basados en la técnica ELISA para la detección de la proteína NS1,
fáciles de utilizar, con equipos comunes y resultados rápidos, que permiten confirmar la infección en suero o plasma, incluso durante los tres primeros días de iniciada la fiebre, periodo en el cual la prueba tiene una sensibilidad que oscila entre 64 y 100 % y una especificidad de 100 %. En este mismo periodo, la prueba ELISA para IgM específica tiene una sensibilidad entre 0 y 50 %. (Dussart P., 2006)
Cada kit contiene el Calibrador, Control Positivo y Negativo. Aceptable los valores para éstos son encontrados en la hoja de la especificación acompañante. El Control y negativo es querido para supervisar para el sustancial fracaso del reactivo. Pero el Control no asegurará la precisión en el ensayo.
Respecto a nuestra experimentación, los resultados obtenidos son aceptables dado que salieron acorde a lo esperado, es decir, fueron negativos y positivos respectivamente para los controles y el calibrador contenidos en el kit utilizado. Para el caso de las muestras de nuestra compañera dieron resultados negativos, es decir, que no se detectaron anticuerpos IgG, lo cual nos indica que esta persona no ha estado en contacto con el virus Dengue.
Aparte de Elisa se pueden utilizar metodos moleculares como RT-PCR, electroforesis en gel de agarosa y secuenciación Automátic, asicomo otras pruebas serologicas como Prueba de Neutralización en Placa (NT) y Inmunocromatografia Rápida
CONCLUSIONES
La detección de NS1 mediante la técnica de ELISA es una alternativa de diagnóstico temprano y moderadamente económico que puede confirmar o descartar de manera rápida y oportuna el diagnóstico de dengue y, de esta forma, ayudar a iniciar un tratamiento más apropiado para el paciente especialmente en aquellos lugares endémicos para Dengue, además tiene una facilidad de ser reproducible.
Esto se debe principalmente a que la glicoproteína NS1 es un importante inmunógeno para la detección de infecciones por este virus y, junto con la determinación de IgM, representa un complemento eficiente para el diagnóstico.
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