sábado, 13 de julio de 2019
Sedimento urinario
jueves, 11 de julio de 2019
Plásmidos
AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN DE PLÁSMIDOS OBTENIDOS DE UNA CEPA DE E. coli MEDIANTE UNA LISIS ALCALINA, SU DIGESTIÓN CON ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN Y ANÁLISIS E IDENTIFICACIÓN A TRAVÉS DE ELECTROFORESIS
Los plásmidos son moléculas de DNA extracromosómico, circular y generalmente de pequeño tamaño que se encuentran en muchas especies bacterianas y que se pueden replicar de manera independiente del DNA cromosómico. Los plásmidos no son necesarios para la viabilidad general de la célula, pero pueden contener genes que contribuyen a la supervivencia en condiciones especiales, como los que confieren resistencia a antibióticos, a metales etc. Algunas clases de plásmidos poseen además la propiedad conocida como "replicación relajada", esto es, están presentes en forma de muchas copias por célula, lo que facilita enormemente su aislamiento y purificación. (Galván, 2008)
Los plásmidos poseen un interés singular en Ingeniería Genética por ser uno de los sistemas vectores más sencillos de usar. Un vector de clonación es un sistema que permite introducir en una célula hospedadora un fragmento de DNA que se pretende clonar; en esta célula hospedadora el vector se replica y expresa, en su caso la molécula que resulta de la unión de un DNA vector con el DNA de interés (denominado entonces "inserto") se denomina molécula de vector recombinante. (Galván, 2008)
Para ser utilizado como vector de clonación, un plásmido ideal debe poseer al menos tres características:
1) Debe tener su propio origen de replicación y por tanto la capacidad de replicación autónoma independiente del genoma del hospedador.
2) Debe tener sitios de clonación múltiple que permitan la apertura del DNA con enzimas de restricción y hace posible la clonación de insertos de DNA en la forma y orientación determinada.
3) Debe poseer marcadores genéticos seleccionables que permiten aislar las células hospedadoras que contengan el vector.
La mayoría de los plásmidos naturales no cumplen todas estas condiciones, por lo que una primera tarea de la Ingeniería Genética ha consistido en la construcción de plásmidos artificiales, combinando en una misma molécula diversos rasgos útiles procedentes de los plásmidos naturales. (Galván, 2008)
El método empleado para la obtención del plásmido se denomina de "lisis alcalina": se basa en la desnaturalización y precipitación selectiva del DNA cromosómico en medios con NaOH y SDS. En estas condiciones el DNA plasmídico permanece intacto debido principalmente a su pequeño tamaño y su naturaleza circular y superenrollada.
Endonucleasas de restricción también llamadas enzimas de restricción, son proteínas bacterianas que cortan en secuencias cortas y específicas al DNA. Son las principales herramientas de la tecnología del DNA recombinante.
Las enzimas de restricción se denominan según el organismo en el que se descubrieron, utilizando un sistema alfanumérico. La enzima EcoRI proviene de Escherichia coli; HindIII se descubrió en Hemophilus influenzae. Se nombran a partir de las bacterias de las que son extraídas, su nombre está dado según el género y la especie de la bacteria de donde se aisló por primera vez esta enzima. La primera letra representa el género de la bacteria, las próximas dos indican la especie, una cuarta letra indica la cepa, y un número al final indica la cantidad de enzimas que se han aislado de esa cepa.(Cultek, 2006)
Hay dos tipos de enzimas de restricción:
• Las enzimas de Tipo I cortan las dos cadenas del DNA en una posición aleatoria a cierta distancia del sitio de restricción.
• Las enzimas de Tipo II reconocen una secuencia específica y cortan las dos cadenas de la molécula de DNA con absoluta precisión dentro de la secuencia reconocida. Las secuencias reconocidas son palindrómicas, es decir, la secuencia de una de las cadenas leída en dirección 5' -> 3' es la misma que la secuencia de la cadena complementaria leída también en dirección 5' -> 3'. (Cultek, 2006)
La enzima de restricción EcoRI reconoce y se une a la secuencia palindrómica GAATTC. El corte del DNA en este sitio produce colas de cadena sencilla complementarias. La colas de cadena sencilla resultantes pueden unirse con colas complementarias de otros fragmentos de DNA para formar moléculas de DNA recombinante. (Cultek, 2006)
HindIII es una enzima de restricción de tipo II posee una diana de restricción en el DNA; AAGCTT, de cadena doble dependiente de una secuencia metilada, palindrómica y asimétrica, sobre la cual su actividad catalítica hidrolasa genera extremos cohesivos. (Cultek, 2006)
El objetivo de la práctica primero fue llevar a cabo el aislamiento y la purificación del DNA de plásmido contenido en una cepa de E.coli mediante la técnica de miniprep por lisis alcalina, después realizar la digestión simple y doble del plásmido pDEST22 con las enzimas de restricción EcoRI y HindIII, con y sin RNAsa para apreciar el efecto del RNA como contaminante y finalmente por electroforesis en agarosa analizar los topoisómeros generados a partir de la digestión correspondiente.
OBSERVACIONES Y RESULTADOS
En primer lugar se llevó a cabo el aislamiento y la purificación de los plásmidos contenidos en una cepa de E.coli mediante la técnica de Miniprep por lisis alcalina. Después se cuantificó y evaluó su pureza mediante espectrofotometría.
REFERENCIAS
Cultek S. L.U. (2006). Tecnología del DNA recombinante. Recuperado de http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/DNA-recombinante/Tecnica%20DNA%20recombinante.pdf
Galván, A. (2008). Aislamiento y purificación del DNA de un plásmido recombinante. Recuperado de http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/39%20AISLAMIENTO%20Y%20PURIFICACI%C3%93N%20DEL%20DNA%20DE%20UN%20PL%C3%81SMIDO%20RECOMBINANTE.pdf
domingo, 19 de mayo de 2019
domingo, 12 de mayo de 2019
Coprológico
[1] García B. J., Silva G, C., (2004), manual de laboratorio de analisis clinicos, 1a ed, España, editorial Mad, S.L.
Electrolitos en sangre
Un electrolito es un mineral que está en los líquidos del organismo y que tiene una carga eléctrica. Son los iones libres de sodio, potasio, calcio, fósforo, magnesio, etc. Estos participan en los procesos fisiológicos del organismo, manteniendo un complejo equilibrio entre el medio intracelular y el medio extracelular.(3)
Cada electrolito tiene una concentración característica en el plasma sanguíneo, el líquido intersticial y el líquido celular. Son importantes para regular la osmolaridad o concentración de partículas en el plasma sanguíneo y otros líquidos del organismo. También determinan el nivel de hidratación y el pH de los líquidos corporales.
La osmolaridad entre los líquidos intra y extravascular se encuentra en equilibrio aunque existan diferentes osmoles o solutos en cada compartimento determinado por la permeabilidad, transportadores y bombas activas en las membranas celulares.(1)
Para la determinación del balance de los distintos electrolitos que forman parte del metabolismo mineral en los líquidos biológicos del organismo se realizan distintas técnicas como la fotometrìa de llama, la espectrometrìa de absorciòn atòmica, el anàlisis de activación de neutrones, la fluorescencia con rayos X electrodos específicos para iones y las técnicas colorimétricas.(2)
La técnica usada en esta práctica para la determinación de Calcio, Fosfato, Magnesio (minerales más abundantes del organismo) y Cloruros en suero fue la técnica colorimétrica usando el rango de uv - visible del espectro electromagnetico.
El calcio es el tercer ión más abundante en el organismo. La concentración plasmática se encuentra entre 8.5 y 10 mg/dl, de los cuales 40% se une a proteínas principalmente albúmina y 60% es difusible. El 10% restante esta unido a citrato, fosfato y bicarbonato.La concentracion plasmatica del calcio esta regulada por la interaccion entre absorcion intestinal, la reabsorcion a nivel renal y el ciclo del calcio esqueletico. Estos tres procesos biológicos están determinados por el efecto combinado de la hormona paratiroidea y la vitamina D3 o colecalciferol. (1) El valor obtenido de Calcio fue de 8.24 mg/dl, dicho valor se encuentra por debajo de los valores de referencia . Las causas de hipocalcemia incluyen insuficiencia renal, hipoparatiroidismo idiopático o postquirúrgico, hipermagnesemia, pancreatitis aguda, deficiencia de vitamina D así como transfusiones de sangre y medicamentos antineoplásicos.(1)
El magnesio está presente en un 60% del magnesio está en el hueso, 39% en el espacio intracelular y solo 1% en el extracelular.(1) El magnesio tiene diversas funciones, interviene en los procesos de excitabilidad, por lo que su carencia provoca convulsiones y su exceso narcosis; es indispensable para la actividad de diversas enzimas enzimas e interviene, con los fosfatos en la formación de sales insolubles en los huesos.(4) La determinación sérica de magnesio no refleja el contenido total ni las alteraciones clínicas inducidas por el mínimo y por lo tanto, su valor diagnóstico es limitado. (1) El valor obtenido de Magnesio fue de 2.36mg /dl, este valor esta dentro de la referencia, por lo tanto no hay sospechas de hipermagnesemia o deficiencia de magnesio.
El fósforo es un mineral que constituye el 1% del peso corporal total de una persona.
El fósforo como molécula de fosfato inorgánico, forma parte de las moléculas de ADN y ARN, las células lo utilizan para almacenar y transportar la energía mediante el ATP. Además, la adición y eliminación de grupos fosfato a las proteínas, fosforilación y desfosforilación, respectivamente, es el mecanismo principal para regular la actividad de proteínas intracelulares. (3) Para esta determinación obtuvimos un valor de 5.8 mg/dL dicho valor se encuentra dentro de los valores de referencia, por lo que no se sospecha de ninguna patología. La deficiencia de fósforo, si bien es muy poco frecuente, puede provocar pérdida de hueso, debilidad, anorexia y dolor. El fósforo en la dieta es habitualmente abundante y su absorción en el intestino en general no tiene limitaciones, por esta razón, raramente constituye un problema nutricional. La regulación más importante de los niveles de fósforo en la sangre ocurre a nivel renal (eliminación por la orina). Este control conlleva una importante regulación hormonal por parte de la hormona paratiroidea (PTH) y el llamado factor de crecimiento de fibroblastos 23. (3)
El cloruro es un macromineral esencial, necesario para mantener el equilibrio apropiado de los líquidos corporales y es una parte esencial de los jugos digestivos (gástricos), es esencial para la vida. Lo absorbemos a través del intestino delgado y encontramos en nuestro cuerpo sus mayores concentraciones en el fluido cerebro - espinal. Se regula y excreta por la orina, el sudor y el intestino. Está presente en forma de compuesto con el Sodio y el Potasio. Entre las principales funciones que desempeña: Es un regulador del equilibrio ácido-base de los líquidos del organismo, Regula la presión que permite a los fluidos corporales entrar y salir a través de las membranas celulares, Mantiene en buen estado los tendones, Acompañado siempre del Sodio y del Potasio, regula el balance electrolítico, Favorece la correcta contractibilidad muscular. (1) El valor obtenido fue normal de un valor de 101.817 mmol/mL. No hay sospecha de presentar hipercloremia ni hipocloremia.
La biodisponibilidad del mineral, es decir, la fracción ingerida que puede ser asimilada y utilizada en las funciones metabólicas, está influida por muchos factores como ingesta, estado nutricional, edad, actividad física, embarazo, entre otras. (3)
Bibliografía:
(1) Ruiz Reyes, Guillermo; Ruiz Argüelles, Alejandro; (2010), “Fundamentos de interpretación clìnica de los exámenes de laboratorio” ,2ª edición, Médica panamericana, Mèxico. Pàg 27,29-31.
(2) R. Gennaro, Alfonso., (2003), “Remington Farmacia”, 20ª edición, Médica panamericana, Buenos Aires, Argentina. Pág 66- 67.
(3) García B. J., Silva G, C., (2004), manual de laboratorio de analisis clinicos, 1a ed, España, editorial Mad, S.L.












